拟穴青蟹VIH基因的克
发布时间：2020-10-18 06:29
卵黄抑制激素(vitellogenesis-inhibiting hormone,VIH)是甲壳动物高血糖激素家族特有的成员之一,作为一种重要的神经肽激素,在调控甲壳动物卵黄蛋白原的生成过程中起到关键的作用。本研究是在课题组已有的部分VIH基因片段的基础上,通过Genome walker、Tail-PCR和常规PCR等技术克隆获得该基因的cDNA全长和基因组DNA序列以及5’调控区序列。并结合体外重组表达、细胞培养、瞬时转染和双荧光素酶报告基因检测等方法,在转录调控和翻译水平揭示VIH的结构特征和本身的转录调控机制。主要研究结果如下:1)采用Genome walker技术克隆出SpVIH基因的cDNA全长634 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为375 bp,可编码125个氨基酸,包括信号肽(1-22aa)和成熟肽两部分。成熟肽包括CHH家族中6个位置较为保守的半胱氨酸(Cys)残基,同时在成熟肽第12位有CHH家族II型肽特有的Gly~(12)。同源性比对和系统进化树分析均表明,SpVIH属于CHH家族II型肽。空间结构分析表明,其与南美白对虾(LvVIH)的空间结构高度相似,由5个α螺旋和多个无规则卷曲组成。2)采用常规PCR技术首次克隆出SpVIH基因的gDNA全长790 bp,由2个外显子和1个内含子组成,外显子和内含子均位于ORF内,内含子在SpVIH成熟肽Arg(AGG)和Arg(AGG)的密码子之间。其内含子和外显子之间并不遵循典型的“GT-AG”或“AT-AC”规则。3)通过原核表达技术对SpVIH的成熟肽部分进行体外重组表达,在29 kDa和31 kDa左右同时出现两条蛋白条带。经液相色谱质谱联用分析显示,上下两种蛋白测出的肽段序列与已知蛋白序列的覆盖率分别为57.8%和61.8%,均认为是目的条带。同时对29 kDa左右的蛋白进行镍柱纯化,并制备多克隆抗体。经western blot验证后,发现该抗体能特异地和这两个大小不一的蛋白结合。4)通过Genome walker和Tail-PCR联用技术克隆获得VIH基因的5’上游调控区序列,从翻译起始位点(ATG)起,共3070 bp,从预测的转录起始位点(A)起,共2398 bp。CpG岛预测软件分析其不含CpG岛。通过生物信息学预测软件和启动子活性分析表明,其核心启动子区位于-203 bp—+213 bp之间,包含在线软件预测的转录起始位点区域。在转录起始位点(A)上游-28 bp处存在TATA box。将pSpVIH-1(含核心启动子区)重组至转基因载体pEGFP-1上,在HEK293FT细胞中能驱动EGFP的表达。5)不同长度缺失片段启动子活性分析表明,在pSpVIH-4和pSpVIH-6之间可能同时存在正调控和负调控的转录因子。对该区域预测的Sox9结合位点进行位点突变和活性分析,发现突变该位点其活性发生显著性降低(p0.05),表明Sox9可能是正调控拟穴青蟹VIH基因表达的重要转录因子。
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q78;S917.4
【部分图文】：
图 3.4 SpVIH 的系统进化树分析所用 CHH 氨基酸序列的物种名和相应的登录号分别为：拟穴青蟹（Scylla paramamosain）CHH， AFM35652.1； 蓝蟹（Callinectes sapidus）CHH2，ACH85179.1；罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii） CHH，AF372657_1；三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）CHH，ACB46189.1；日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）CHH，BAE78493.1；普通滨蟹（Carcinus maenas）CHH，AF286094_1；南美白对虾（Litopenaeus vannamei）CHH-B，AAN86057.1；欧洲龙虾（Homarusgammarus）CHH-B，ABA42180.1；斑节对虾（Penaeus monodon）CHH1，AAQ24525.1；美洲海螯虾（Homarus americanus）CHH-A，AAB32871.1；云斑厚纹蟹（Pachygrapsus marmoratus）CHH，AAM21927.1； 刀额新对虾（Metapenaeus ensis）CHH，BAJ23164.1。 所用 VIH/GIH 氨基酸序列信息如图 3.4 注释。 拟穴青蟹 SpVIH 用红色菱形（ ）标注，节点数字代表置信度，树枝长度代表遗传距离。3.5 SpVIH 空间结构的预测利用 SWISS-MODEL 在线同源建模方法和三维结构模型查看软件 PyMOL，分别对SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空间三维结构进行模拟。结果显示 SpVIH 由 5 个α螺旋和多个无规则卷曲组成（图 A），与 LvVIH 的空间结构（图 B）极其相似。去除 SpVIH 成熟肽12
图 3.5 SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空间三维结构的模拟A：SpVIH 的空间三维结构； B：LvVIH 的空间三维结构；C：去除成熟肽 Gly12 后 SpVIH 的空间三维结构；D：SpCHH1 的空间三维结构。3.6 原核表达3.6.1 含酶切位点目的片段的获得以拟穴青蟹眼柄逆转录后的cDNA第一条链为模板，根据SpVIH基因的ORF（去除信号肽后对应的核苷酸序列）序列分别设计含有酶切位点BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，进行PCR扩增获得300 bp左右的基因片段，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3.6）。将目的条带进行割胶回收并测序后，最终得到324 bp的基因序列（包括酶切位点和保护碱基序列），且与已知序列完全一致。
肽后对应的核苷酸序列）序列分别设计含有酶切位点BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，进行PCR扩增获得300 bp左右的基因片段，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3.6）。将目的条带进行割胶回收并测序后，最终得到324 bp的基因序列（包括酶切位点和保护碱基序列），且与已知序列完全一致。
【参考文献】
本文编号：2845933
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q78;S917.4
【部分图文】：
图 3.4 SpVIH 的系统进化树分析所用 CHH 氨基酸序列的物种名和相应的登录号分别为：拟穴青蟹（Scylla paramamosain）CHH， AFM35652.1； 蓝蟹（Callinectes sapidus）CHH2，ACH85179.1；罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii） CHH，AF372657_1；三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）CHH，ACB46189.1；日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）CHH，BAE78493.1；普通滨蟹（Carcinus maenas）CHH，AF286094_1；南美白对虾（Litopenaeus vannamei）CHH-B，AAN86057.1；欧洲龙虾（Homarusgammarus）CHH-B，ABA42180.1；斑节对虾（Penaeus monodon）CHH1，AAQ24525.1；美洲海螯虾（Homarus americanus）CHH-A，AAB32871.1；云斑厚纹蟹（Pachygrapsus marmoratus）CHH，AAM21927.1； 刀额新对虾（Metapenaeus ensis）CHH，BAJ23164.1。 所用 VIH/GIH 氨基酸序列信息如图 3.4 注释。 拟穴青蟹 SpVIH 用红色菱形（ ）标注，节点数字代表置信度，树枝长度代表遗传距离。3.5 SpVIH 空间结构的预测利用 SWISS-MODEL 在线同源建模方法和三维结构模型查看软件 PyMOL，分别对SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空间三维结构进行模拟。结果显示 SpVIH 由 5 个α螺旋和多个无规则卷曲组成（图 A），与 LvVIH 的空间结构（图 B）极其相似。去除 SpVIH 成熟肽12
图 3.5 SpVIH、LvVIH 和 SpCHH 空间三维结构的模拟A：SpVIH 的空间三维结构； B：LvVIH 的空间三维结构；C：去除成熟肽 Gly12 后 SpVIH 的空间三维结构；D：SpCHH1 的空间三维结构。3.6 原核表达3.6.1 含酶切位点目的片段的获得以拟穴青蟹眼柄逆转录后的cDNA第一条链为模板，根据SpVIH基因的ORF（去除信号肽后对应的核苷酸序列）序列分别设计含有酶切位点BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，进行PCR扩增获得300 bp左右的基因片段，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3.6）。将目的条带进行割胶回收并测序后，最终得到324 bp的基因序列（包括酶切位点和保护碱基序列），且与已知序列完全一致。
肽后对应的核苷酸序列）序列分别设计含有酶切位点BamH I的上游引物和Xho I的下游引物，进行PCR扩增获得300 bp左右的基因片段，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图3.6）。将目的条带进行割胶回收并测序后，最终得到324 bp的基因序列（包括酶切位点和保护碱基序列），且与已知序列完全一致。
【参考文献】
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本文编号：2845933
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