不同倍性鲫鲤性腺发育相关基因和miRNAs的鉴定及功能分析

发布时间：2020-10-19 13:01

　　多倍体化是物种进化的重要特征。远缘杂交是将一个物种的基因组转移到另一个物种中的有效方法,从而使得杂交后代在表型上显示出杂种优势以及在基因型上形成多倍体。在红鲫(Carassius,auratus red var.,RCC,♀)和鲤鱼(Cyprinuscarpio,CC,3)之间远缘杂交产生的F2代中发现产生了不减数的二倍体配子,运用人工方法将F2代进行自交得到了异源四倍体鲫鲤(4nAT),目前已获得遗传稳定的两性可育的异源四倍体鱼品系(F3-F27)。本实验室通过改良红鲫和改良异源四倍体鲫鲤进行杂交得到了不育三倍体湘云鲫2号。三倍体鱼的精巢正常发育但是却没有正常的精子产生,由于三倍体鱼的性腺败育,具有在任何水域进行养殖都不会对自然界中的种质资源造成影响的特点而在中国被广泛养殖。Dnah3与精子的鞭毛组装、鞭毛的运动以及精子的活动有关。Ift57对维持鞭毛的长度和双向物质运输是不可或缺的,这两个基因的异常突变都会导致精子鞭毛发生异常,进而无法产生正常精子而败育。本小组在前期的研究中已成功构建了不同倍性鲫鲤精巢中的miRNAs文库,通过对miRNA的靶基因进行预测,我们发现Dnah3和Ift57分别是miR-199-5p和miR-221的靶基因,在本研究中对Dnah3基因和If57基因的部分cDNA序列进行了克隆,并对这两个基因在不同倍性鲫鲤组织中进行了半定量表达分析以及在精巢组织中进行了定量研究分析。microRNAs(miRNAs)是真核生物内一类基因长度大约为17-24nt内源性的非编码小分子RNA。miRNAs通过与其靶基因mRNA的3'UTR区完全或是不完全互补配对的方式对基因进行表达调控。越来越多的研究表明,miRNA与器官的形成、胚胎发育、肿瘤发生以及细胞的增殖、分化、凋亡等均有密切的关系。在本文中,我们构建了红鲫和异源四倍体鲫鲤卵巢的miRNAs文库,且在多个方面对文库进行了生物信息学分析并通过相关实验对所得测序数据进行验证。1.克隆并分析了Dnah3基因在二倍体红鲫、异源三倍体鲫和异源四倍体鲫鲤中的部分cDNA序列,并对其进行了不同倍性鲫鲤9种组织中的差异性表达分析和研究,结果表明在精巢中的表达量高于其他组织。通过qPCR研究基因在不同倍性鲫鲤精巢中的表达。qPCR结果显示在不育三倍体鱼中的表达量比在可育二倍体鱼和四倍体鱼中低。2.克隆并分析了If57基因在二倍体红鲫、异源三倍体鲫和异源四倍体鲫鲤中的部分cDNA序列,并对其进行了不同倍性鲫鲤9种组织中的差异性表达分析和研究,结果表明在精巢中的表达量高于其他组织。通过qPCR研究基因在不同倍性鲫鲤精巢中的表达,qPCR结果显示不育三倍体鱼中的表达量比在可育的二倍体鱼和四倍体鱼中低。3.分别取红鲫和异源四倍体鲫鲤各三条卵巢组织样本,提取RNA后进行高通量测序,对数据筛选后得到的clean reads分别为:1,252,130条(HJ1♀)、13,885,093条(HJ2♀f)、10,318,700条(HJ♀f)、12,888,037条(4nl♀f)、13,012,243条(4n2♀f)、11,342,865条(4n早f)。利用MIRDeep2软件将miRNA序列mapped到参考基因组上,结果显示,在二倍体红鲫中有441条成熟的miRNAs序列;在异源四倍体鲫鲤中共有418条miRNAs序列。经Illumina HiSeq 2500测序平台分析发现,相对二倍体在4nAT中有9条保守miRNAs表达下调,30条保守miRNAs和4条非保守miRNAs是表达上调。基于高通量测序的结果,我们选取了五个在不同倍性鱼类卵巢中差异表达的miRNAs(miR-6843-3p,miR-8lb-p,miR-42-5p,miR-21-5p,and miR-2368-3p),通过qRT-PCR验证其相对表达水平。qRT-PCR结果与高通量测序的结果一致。然后我们将具有明显表达差异的miRNA在miRanda数据库对目标基因序列进行预测,与NR、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG数据库进行BLAST比对后,对目标基因进行功能注释和分类。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

方式,信号通路,靶基因,受控

选择及其影响因素还不是很确定，推测这可能由特定的ｍｉＲＮＡ和靶基因，或是??特定的组织和细胞来决定，也可能受控于不同的信号通路。下图为ｍｉＲＮＡ的两??种作用于靶ＲＮＡ的方式（图１－１）?［５４】。??７??

倍性,基因,异源三倍体,异源四倍体鲫鲤

环阈值（ＣＴ）并进行绘图表达。??２．２．５．３实验结果和分析??用ｑＰＣＲ的实验方法，运用２－ＡＡＣ：ｔ方法计算并作图得到如图２－１的表达量图??谱。??１０????８?－??５Ｃｌ—?Ｉ??ｔｅｓｔｉｓ－ｄｎａｆ＞３??■■■■■?２ｎ?＿Ｘ?Ｄａｔａ??Ｉ?ｔ?３ｒｉ??此■滅４ｎ??图２－ｌ?基因在不同倍性鲫鲤中的表达量??Ｆｉｇ．２－ｌ?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｄｎａｈ３?ｇｅｎｅ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｌｏｉｄｙ?Ｃｙｐｒｉｎｉｄｓ??注：２ｎ：二倍体红鯽（ＲＣＣ）?；?３ｎ：异源三倍体鲫鱼；４ｎ：异源四倍体鲫鲤（４ｎＡＴ）??用不同倍性鲫鲤的精巢组织进行的实时荧光定量ＰＣＲ验证，实验结果显示，??在异源三倍体鲫鲤中基因的表达量相对于二倍体红鲫和异源四倍体鲫鯉??中的表达量下调。??２．２．６Ｚ）；７ｆｌＡ３基因在不同组织部位的表达??在克隆获得基因的部分序列后，提取不同倍性鲫鲤的脑、心脏、肾脏、??肝脏、肌肉、卵巢、垂体、脾脏、精巢这９个组织的总ＲＮＡ，实验步骤见２．２．１。??然后将其分别反转录为ｃＤＮＡ，实验方法见２．２．２。用半定量ＲＴ－ＰＣＲ的实验方法研??宄该基因在红鯽，异源三倍体鲫鱼以及在异源四倍体鲫鲤的９种不同组织中的表??达，反应体系如下表（表２－８）。??１８??

不同倍性鲫鲤性腺发育相关基因和miRNAs的鉴定及功能分析