传染性造血器官坏死病毒G基因截短原核表达及其免疫原性研究

发布时间：2020-10-22 02:46

　　 传染性造血器官坏死(Infectious haematopoietic necrosis,IHN)是由弹状病毒科,粒外弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)感染引起的,可以感染所有的鲑科鱼类,是一种急性的具有高度传染性的病毒性疾病,高致病力毒株对鲑鳟幼鱼的致死率达90%以上,该病现已成为世界性鲑鳟鱼病,给鲑鳟养殖业带来重大经济损失。但目前尚无治疗IHN的有效药物,疫苗仍是预防IHNV的最有效手段之一。IHNV的主要抗原蛋白是表面糖蛋白G,含有可诱导细胞产生免疫中和抗体的中和抗原表位。本实验利用生物信息学原理对其G蛋白基因序列进行信号肽区、疏水性跨膜区和抗原表位区的生物信息学分析IHNV HLJ-09株,利用大肠杆菌表达系统对G蛋白基因片段进行截短重组表达,分析表达蛋白的免疫原性和诱导虹鳟幼鱼免疫保护的效果。试验结果显示:1.构建了pET-28a-dG原核表达载体,经IPTG诱导后,获得53 kDa的目的蛋白。目的蛋白纯化后经Western blotting检测,目的蛋白可与鼠抗IHNV全病毒血清特异性识别,具有良好的免疫原性。2.利用纯化的目的蛋白(dG)制备鼠抗血清,经酶联免疫吸附试验检测该鼠抗血清均能与重组蛋白和IHNV HLJ-09株反应,其效价分别是1:25600和1:1600。利用制备的鼠抗血清进行了病毒中和试验测定,根据Reed-Muench氏法,得出其中和效价为1:112,说明该鼠抗血清能识别IHNV并能产生相应的中和抗体,具有一定的中和效应。3.为分析IHNV dG诱导虹鳟幼鱼的免疫保护效果,将纯化后的目的蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后接种虹鳟幼鱼,试验分为3组,即灭活疫苗组、重组蛋白组和PBS对照组,每尾2μg/g鱼体重的剂量进行腹腔注射。免疫后的第0、1、2、3、4、5、6周采集鱼血清,检测其特异性抗体IgM水平。结果显示,免疫后实验组鱼抗体水平显著提高(P0.01),并且显著高于对照组(P0.01),在免疫后的第四周达到高峰,随后下降。在免疫后的第四周进行攻毒保护试验结果显示,灭活疫苗组和重组蛋白组的相对保护率分别为62%和60%。以上结果表明,本研究利用大肠杆菌原核表达系统表达的截短IHNV G蛋白,能够作为IHNV亚单位疫苗的候选免疫原,可诱导虹鳟幼鱼产生中和抗体,抵抗IHNV的攻击,为进一步研究IHNV的亚单位疫苗奠定了一定理论基础。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S941.414
【部分图文】：

类地位及生物学特征类委员会（ICTV）对弹状病毒描述，IHNV属于代表，与它同属的还有病毒性出血败血症病毒V）、蛇头鱼弹状病毒（Snakehead rhabdovirus,SHvirus,HIRRV），它们的共同特征是在糖蛋白和聚粒外弹状病毒属的一个独特的、非结构蛋白，因科，粒外弹状病毒属（Novirhabdovirus）的成员[2M、N 和 L 五种结构蛋白质和一种非结构蛋白（磷酸化蛋白，糖蛋白，膜基质蛋白，核衣壳蛋白成病毒的外形，圆柱形核衣壳螺旋形成二十面体×60~100 nm，核心直径 60 nm，轴孔直径 20 nm状突起，有囊膜和膜粒。由核衣壳、膜蛋白、囊本结构，如图 1-1 所示。核糖核蛋白（RNP）复和聚合酶大蛋白三者与病毒的 RNA 之间的相互契和表达的模板被酶降解，保证了遗传信息得以正确

经常不被研究者使用。而大鳞大马哈鱼胚胎细胞系（CHSE-214）、鲤细胞系（EPC）具有繁殖快，对环境的敏感度小等特点而被广泛的应用，并产生细应（cytopathic effect，CPE）。CPE特征为细胞核内染色质呈颗粒状、边缘化，核膜变大；最后细胞崩解成细胞碎片[31]。IHNV的最适生长温度为14~16℃[20]。在IHNV-214细胞有很强的适应性，在CHSE-214细胞上能够快速的繁殖，仅4个小时即可增殖的16 h内呈指数生长，最后生长到达平稳期[32]。 IHNV 的基因组结构HNV是基因组大小约为11131 bp的单股负链不分节段的RNA病毒，由磷酸化蛋白P、、膜基质蛋白M、核衣壳蛋白N和RNA聚合酶大蛋白L五种结构蛋白质和一种独特的白（NV）组成。基因组由各蛋白基因紧密相连，其各蛋白基因的连接顺序为3’端白-磷酸化蛋白-膜基质蛋白-糖蛋白-NV-聚合酶大蛋白-5’端。其基因组的结构模式，所示，有约60个碱基组成的基因短序列在3’端形成，此基因短序列是不被翻译的前导前导区含有上游RNA转录终止信号和下游基因转录起始信号，紧随其后的为基因编因连接区，最后为基因的5’端，在5’端还有一个约101个碱基的短序列[33]，此段短序游基因转录终止信号和多聚腺苷酸化信号[33]。

东北农业大学农学硕士学位论文分析HLJ-09 株 G 截短基因片段的选择MHMM Server v.2 软件对 IHNV HLJ-09 株 G 基因片段跨膜区的84-1836 位氨基酸之间存在一个跨膜螺旋区，跨膜区属于疏水的形成都是在由亲水性氨基酸为基础的，疏水区则会对其有影响达，因此要避开此区域。
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本文编号：2850987