草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白与草鱼蛋白酶体亚基β7（PSMB7）相互作用的研究

发布时间：2020-10-22 04:38

　　 草鱼(Ctenopharyngon idellus)是亚洲国家广泛养殖的重要淡水经济鱼类,是我国传统的“四大家鱼”之一。但草鱼出血病的时常爆发给草鱼养殖业带来了巨大的损失。草鱼呼肠孤病毒是导致草鱼出血病的主要病毒性病原。在我国分离出来的数十株草鱼来源呼肠孤病毒中,可分为草鱼Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型呼肠孤病毒,它们的代表株分别为GCRV-873、GCRV-HZ08和GCRV-104。蛋白酶体是细胞内负责降解细胞内错误折叠、异常累积、衰老损伤等蛋白质的主要细胞器之一,是非溶酶体-泛素依赖型蛋白降解过程中的核心蛋白酶,参与了细胞内蛋白质控,抗原处理,信号转导,细胞周期调控,细胞分化以及细胞凋亡等多种过程。本研究利用酵母双杂交技术发现了草鱼PSMB7蛋白与草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38之间存在潜在的相互作用,并利用多种现代分子生物学技术验证了草鱼三种基因型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7,VP35,VP38与PSMB7之间的相互作用。具体研究内容如下:1.利用酵母双杂交技术筛选与草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒VP6和VP38相互作用的宿主蛋白利用酵母双杂交筛选了能与GCRV104 VP6和VP38相互作用的宿主蛋白。利用RT-PCR扩增GCRV104 s8和s10基因组片段,构建诱饵质粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38;对重组质粒进行细胞毒性和自激活检测,分别以VP6和VP38为诱饵在草鱼酵母文库中筛选与其相互作用的宿主蛋白,对筛选得到的阳性酵母菌落进行测序分析。结果表明,两个诱饵质粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38均无自激活作用;诱饵质粒pGBKT7-VP6筛选到7株阳性克隆,分别编码β肌动蛋白、augmin样复合体亚基2、甘露糖苷酶α2b1亚基、程序性细胞死亡蛋白6、真核翻译延长因子1γ和一个未知功能蛋白;诱饵质粒pGBKT7-VP38筛选到4株阳性克隆,分别编码剪切与多聚腺苷酸化特异性因子5、高迁移率组蛋白核小体结合结构域2、葡萄糖转运体X和蛋白酶体亚基β7。2.GCRV-104 VP38与PSMB7的表达分析以及多克隆抗体制备为进一步研究VP38的生物学功能,及为后续实验准备良好的实验材料,实验构建了VP38蛋白的原核表达质粒pET28a-VP38,转化至大肠杆菌感受态BL21中,经IPTG诱导表达之后纯化蛋白,免疫小鼠,制备多克隆抗;利用Western blot及IFA对所得鼠抗VP38多克隆抗体进行评估,同时利用该多克隆抗体对GCRV-104感染CIK细胞后不同时间点VP38的表达特性进行分析。结果显示本实验制备的多克隆抗体能够特异性地识别原核表达的重组蛋白及GCRV-104感染细胞样品中的VP38蛋白;VP38蛋白在感染72 h后主要分布在宿主细胞的细胞质中,呈均质分布;VP38在GCRV104感染前期微量表达,中后期大量表达。为进一步验证PSMB7与VP38的相互作用,探究PSMB7在病毒感染过程中的表达特性以及具体功能,我们根据草鱼转录组数据库信息,利用RT-PCR扩增了PSMB7的全长ORF,同时对PSMB7的基因序列及氨基酸序列进行了分析,构建了PSMB7的原核表达质粒pET28a-PSMB7及真核表达质粒pEGFP-N1-PSMB7;pET28a-PSMB7转化至BL21感受态细胞后,利用IPTG诱导蛋白表达,将纯化后的蛋白免疫小鼠,获得鼠源多克隆抗体;利用Western blot对制备的多克隆抗体进行分析;pEGFP-N1-PSMB7转染至GCO细胞后进行亚细胞定位分析;结果表明,草鱼psmb7基因全长834bp,编码277个氨基酸,具有保守性酶活位点,为Ntn-水解酶超家族成员;PSMB7在GCO细胞中主要分布在核周区域;实验制备的PSMB7多克隆抗体能够特异性识别草鱼CIK细胞及GCO细胞的内源PSMB7蛋白,该多抗具有较高的效价和较好的特异性。3.草鱼三种基因型呼肠孤病毒外衣壳蛋白与蛋白酶体亚基β7(PSMB7)的相互作用本章节利用定向酵母双杂交技术、Far western blot、His Pull-Down、细胞内共定位、Co-IP等技术验证了VP38与PSMB7之间的相互作用;并利用酵母双杂交、Co-IP验证了PSMB7同时也能够与草鱼Ⅰ型和Ⅱ型呼肠孤病毒的外衣壳蛋白VP7和VP35相互作用;对PSMB7进行截断,利用酵母双杂交实验探究了不同截断与VP38的相互作用;利用制备的多克隆抗体及realtime RT-PCR对病毒感染后PSMB7在翻译及转录水平上的表达量变化进行了监测。结果显示PSMB7与草鱼三种基因型呼肠孤病毒的外衣壳蛋白均发生相互作用;VP38与PSMB7之间为多位点相互作用;GCRV-JX01及GCRV104感染后PSMB7在转录水平下调,而在翻译水平无明显变化。本研究利用酵母双杂交技术筛选了与GCRV-104编码的VP6和VP38蛋白存在潜在相互作用的宿主蛋白,对VP38和PSMB7进行了表达、分析及多克隆抗体的制备,利用多种实验技术验证了PSMB7与草鱼三种呼肠孤病毒外衣壳蛋白的相互作用,探究了PSMB7在病毒感染后在转录及翻译水平的表达量变化,为进一步了解GCRV的感染机制提供了一定的理论基础。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S943
【部分图文】：

图 2-1 s8 和 s10 RT-PCR 扩增结果M：DL2000 标尺；NC：阴性对照 Amplification result of GCRV-104 s8 and s10 bM:DL2000 Marker；NC:Negative Control激活检测DT7 质粒的酵母 AH109 在 SD/-Trp 平GBKT7-VP6/pGADT7 与 pGBKT7-VPu 平板上均生长良好（图 2-2）；分别 与 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH。该结果表明：VP6 蛋白和 VP38 蛋白对

图 2-2 pGBKT7-VP6 与 pGBKT7-VP38 的自激活检测化质粒 pGBKT7-VP6/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板的粒 pGBKT7-VP6/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu-His 平板质粒 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板质粒 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu-His 平Fig.2-2 Self-activation detection of pGBKT7-VP6 and pGBKT7-VP38109 transformants with pGBKT7-VP6/pGADT7 grown on SD/-Trp-Leu09 transformants with pGBKT7-VP6/pGADT7 did not grow on SD/-Trplates;09 transformants with pGBKT7-VP38/pGADT7 grown on SD/-Trp-Le09 transformants with pGBKT7-VP38/pGADT7 did not grow on SD/-Tplates

图 2-3 SD/-Trp-Leu 平板筛选的阳性菌落A：携带有文库质粒与 pGBKT7-VP6 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板上生长(代表平板)；B：携带有文库质粒与 pGBKT7-VP38 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板上生长(代表平板Fig.2-3 Positive clones screened by SD/-Trp-Leu selection platesA ：AH109 transformants with pGBKT7-VP6/ library plasmid grown on SD/-Trp-Leu plates(representative plate)；B：AH109 transformants with pGBKT7-VP38/ library plasmid grown on SD/-Trp-Leu plates(representative plate)AB
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 戈贤平;缪凌鸿;;我国大宗淡水鱼产业发展现状与体系研究进展[J];中国渔业质量与标准;2011年03期

2 陈燕燊,江育林;草鱼出血病病毒形态结构及其理化特性的研究[J];科学通报;1983年18期

本文编号：2851105