斑节对虾(Penaeus monodon)在养殖过程中容易受到环境应激的影响造成经济损失。而热休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)是在生物体抗应激过程中发挥着重要作用的一类进化上高度保守的蛋白。因此本实验拟对斑节对虾三种热休克蛋白,即PmHsp60、PmHsp10和PmGRP94(glucose regulated protein 94,GRP94),进行研究分析,希望进一步了解斑节对虾抗应激内在的一些分子机理。本实验利用已构建的斑节对虾转录组数据库筛选出三个热休克蛋白EST序列,利用cDNA末端快速扩增法(Rapid Amplification of cDNA End,RACE)获得三个基因cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)确定了三个基因在斑节对虾不同组织中的表达分布规律,并研究了三个热休克蛋白基因在不同pH、盐度和重金属应激下mRNA水平的表达变化情况。利用体外重组技术对PmHsp60和PmHsp10进行重组,利用Ni-NTA树脂进行亲和纯化,纯化蛋白经复性后进行分子伴侣活性及PmHsp60 ATPase活性分析。具体研究结果如下:(1)PmHsp60 cDNA全长为2352 bp,其中包含129 bp的5’-非编码区(untranslated region,UTR)、486 bp的3’-UTR和1737 bp开放阅读框(open reading frames,ORF),编码578个氨基酸,PmHsp60分子量为60.99 kDa,其理论等电点为2.48,多重比对显示其有一个高度保守的Chaperonin 60(cpn60)结构域以及环形结构域和ATP结合位点,组织表达结果显示PmHsp60在肝胰腺中表达最高、在鳃中表达最低;PmHsp10 cDNA全长为744 bp,5’-UTR、3’-UTR和ORF分别为102 bp、333 bp和309 bp,ORF编码102个氨基酸,分子量为11.05 kDa,理论等电点为7.8,组织表达结果显示PmHsp10在肝胰腺中表达最高、在鳃和淋巴中表达最低;PmGRP94 cDNA全长2 990 bp,包括75 bp的5’-UTR、527 bp的3’-UTR和2388 bp的ORF,PmGRP94蛋白理论分子量大小和等电点分别为91.32 KDa和4.72,同源比对结果显示,PmGRP94有一个Hsp90保守结构域,N端有一个ATP结合位点,组织表达结果显示其在肝胰腺中表达最高、在淋巴中表达最低。(2)环境应激实验中,斑节对虾进行pH 7.0、pH 9.0、低盐23‰、高盐43‰以及重金属铜(Cu)、锌(Zn)和镉(Cd)应激。PmHsp60、PmHsp10和PmGRP94在应激后不同程度的被诱导表达。在ph7.0应激后鳃中pmhsp60表达水平上调并且在96h达到高峰值,pmhsp10在6h时表达上调,在6h,48h和96h时mrna表达水平达到最大。在肝胰腺中,pmhsp60mrna的表达水平12h和48h上调,而pmhsp10没有明显的变化;在ph9.0应激下,鳃中pmhsp60和pmhsp10转录水平在应激6h后快速上调,12h又下调,在48h处达到最大值。在肝胰腺中,pmhsp60和pmhsp10转录水平在12h处上调,之后下调至正常水平,到96h时其表达量达到最大值;低盐处理后,鳃中pmhsp10在4h达到最大表达量,之后逐渐下调,在肝胰腺中pmhsp10在4h上调,并在4h、8h和32h达到最大表达,而在低盐下,pmhsp60在两个组织中的表达量轻微的上调;高盐度下,鳃中pmhsp60转录水平32h达到最大水平,而pmhsp10表达量在16h处达到最大值,在肝胰腺中pmhsp60和pmhsp10均在4h处上调且维持到16h,之后下调;cu应激下,pmhsp60鳃中转录水平在12h处显著上调,在24h和48h处下调,在96h处达到最大值,pmhsp10在鳃中48h前被轻微的诱导,96h达到最大值,在肝胰腺中二者表达水平和对照比没有明显变化;在zn应激下,pmhsp60和pmhsp10有相似的变化趋势。在鳃中,pmhsp60和pmhsp10在12h达到最大表达量,在肝胰腺中,二者表达量在应激初期就上调,在24h处达到最大值;在cd处理组,鳃中pmhsp60表达量在24h处显著上调并达到最大值,而pmhsp10在12h处达到最大值。在肝胰腺中pmhsp60和pmhsp10最大表达量在6h和48h发现;ph7处理以后,pmgrp94表达量与对照相比12h前变化不明显,在第24h处达到最大表达量,48h和96h表达水平又降低;在ph9处理组,pmgrp94的相对表达量在应激后6h即被诱导,应激后48h其表达量达到最大,应激96h后表达水平又下降,但仍高于正常水平;低盐度组,表达均未出现上调,16h和32h均低于对照;在高盐度应激下,pmgrp94表达量从8h后上调,在16h达到最大表达量,应激后32h表达量下调,但依然高于对照;在cu刺激下,pmgrp94相对表达量在6h达到最大值,之后表达下调并保持相对较低的水平,但还是高于0h对照的表达水平;cd刺激下,pmgrp94mrna转录水平在从6h到96h有轻微的上调,在96h处达最大值;在zn刺激下,pmgrp94表达量应激后12h开始上调,在24h处显著上调,达到最大表达量,之后下调至正常水平。(3)pmhsp60atpase活性测定从0到60°c,在37-42°c时有最高活性。当pmhsp10加入反应体系后。从0到60°c范围内其总活性有所升高,增量最少的温度为60°c。热诱导cs聚集被用来测定pmhsp60分子伴侣活性。在hsp60/cs为1:1时有21%的蛋白被保护。随着pmhsp60的增加,蛋白保护程度得到提高。Hsp60/CS为2:1时约有57%的蛋白被保护,4:1时超过60%蛋白被保护。Hsp60/CS为4:1只有约38%的被保护。而当PmHsp60/PmHsp10/CS混合比例为Hsp60/Hsp10/CS=4:4:1时,约76%蛋白被保护。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
oES(Hsp60-Hsp10)复合体结构。（a）大肠杆菌 GroEL 亚结构域、赤道结构域为灰色，红色的螺旋 H 和 I 为结合）GroEL 端视图；（d-f）对应视图下的 GREL 和 GRESStructures of GroEL and the GroEL–GroES Complex. (a) Serichia coli.Apical, intermediate, and equatorial domains aespectively. Helices H and I involved in the binding of subsre shown in red. (b) Side view of the GroEL. (c) End view alent views of GroEL in complex with the cofactor GroES ase 和蛋白折叠过程。（a）GroEL 结合未折叠的多肽；（
S(Hsp60-Hsp10)复合体结构。（a）大肠杆菌 GroEL构域、赤道结构域为灰色，红色的螺旋 H 和 I 为结GroEL 端视图；（d-f）对应视图下的 GREL 和 GRructures of GroEL and the GroEL–GroES Complex. (aichia coli.Apical, intermediate, and equatorial domainpectively. Helices H and I involved in the binding of su shown in red. (b) Side view of the GroEL. (c) End vieent views of GroEL in complex with the cofactor GroE
上海海洋大学硕士学位论文PmHsp60 ATPase 活性方面进行了分析。为更好的理解斑节对虾在生理水平上对环境的适应机制及热休克蛋白在此调控机制中所起的作用提供前期理论基础。1.4.2 技术路线本论文实验路线如下图所示：
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本文编号：
2855344
