长牡蛎甲状腺激素及其信号通路关键基因的功能研究

发布时间：2020-10-24 17:50

　　 长牡蛎(Crassostrea gigas),生活于潮间带,是全世界重要的水产养殖种类之一。由于其特殊的生态位和较高的经济价值,长牡蛎已成为冠轮动物中得以研究最多的物种之一。在长牡蛎中研究甲状腺激素及其信号通路关键基因不仅有助于加深了解冠轮动物,也为解析无脊椎动物和脊椎动物的内分泌系统进化过程、促进牡蛎产业技术进步提供宝贵的科学信息。本论文的研究内容包括三大块,主要内容和结论如下:1长牡蛎甲状腺激素及其信号通路关键基因的功能研究上个世纪,甲状腺激素(THs,包含T4和T3)被认为只在脊椎动物中发挥作用。近些年,越来越多的证据表明,THs也存在于头索和尾索动物中。然而,目前THs相关的研究在非脊索的无脊椎动物还很少见。为了研究THs的起源与进化,我们选择了冠轮动物的代表—牡蛎为研究对象,通过生理和分子两种手段探讨牡蛎中的THs系统。本研究用高效液相色谱法和液相色谱与质谱串联的方法定性的检测了T4和T3的存在,又用电化学免疫法定量检测了牡蛎发育过程中THs的变化。使用分子手段克隆了一些THs信号通路中的关键基因,包括4个合成酶甲状腺过氧化物酶(PERT),2个代谢酶脱碘酶,一个甲状腺激素受体(TR)。使用荧光定量分析、免疫印迹分析、亚细胞定位、原核表达、酵母双杂交、凝胶迁移电泳(EMSA)、双报告基因技术等一系列分子生物学实验技术,对这些基因进行了功能鉴定。实验数据证明,在牡蛎中也存在甲状腺激素及其信号通路。THs可能参与胚胎形成,生长和变态等一些发育过程。牡蛎胚胎可能通过CgPERT1自体合成THs。牡蛎胚胎可以在体内将T4转化为T3,这项功能可能是由脱碘酶基因(CgDx或CgDy)行使的。CgDx和CgDy的mRNA表达受到THs和CgTR的调控,它们的启动子区域含有TRE。THs可能通过CgTR与TRE结合来调控CgDx和CgDy的转录。这些实验证据说明TH系统的反馈调节机制在牡蛎中也是存在的。CgTR能通过与目的基因的启动子区域结合来调控基因的表达,并能与视黄酸X受体(CgRXR)发生相互作用。CgTR mRNA的表达受到T4和CgTR蛋白的调控,且在CgTR的启动子区域找到了一个甲状腺激素效应元件(TRE)。这些CgTR的功能与脊椎动物的TR一致,说明这些功能在TR的共同祖先中已经存在。然而,CgTR的DNA结合特性和转录激活活性并不保守。与血吸虫的TR相似,CgTR能与DR0-DR5结合。此外,两种双报告实验证明CgTR的转录激活活性不能被T4,T3或TRIAC激活。这些不保守的功能将为TR功能乃至TH系统的进化提供宝贵的线索。这是首次在无脊椎动物中系统地研究THs的生理作用和分子机理。根据本研究获得的结果,我们认为THs及其信号通路在牡蛎中是存在的,可将THs的起源追溯至冠轮动物。2视黄酸X受体RXR的功能研究本研究克隆获得了牡蛎中唯一的RXR基因CgRXR。该基因在胚胎发育过程中表达量较高,说明可能参与到牡蛎的胚胎发育过程。该基因定位于细胞核,为其作为转录因子调控基因表达提供空间便利。通过荧光双报告实验证明CgRXR的转录激活活性可以被9-cis RA、DHA激活,说明CgRXR LBD的结合功能是保守的。CgRXR的转录激活活性也可以被环境污染物三丁基锡(TBT)、三苯基锡(TPT)激活,说明有机锡污染物对牡蛎的毒害作用可能是通过RXR来介导的。EMSA实验结果表明,CgRXR能与DR0-DR5结合,除了与DR4结合较弱外,与其余的探针结合能力相当。双壳类RXR的DNA结合特性不保守,与脊椎动物和腹足类的均有较大差异。3新的核受体亚家族NR8的进化分析和CgNR8A1的功能研究核受体(NR)属于转录因子超级族,它通过调节基因表达来调控后生动物的发育、内稳态、分化和繁殖等。近几年,迅速发展的基因组计划为核受体的进化和功能研究提供了新的机遇。具有典型结构的核受体被分为6个亚家族。本研究在长牡蛎中克隆了一个具有典型结构的核受体(CgNR8A1)。然而进化分析发现该基因不能归类于现有的NR亚家族。通过数据挖掘,我们在后生动物中(包括刺胞动物,软体动物,环节动物,棘皮动物,半索动物和头索动物)又找到了9个CgNR8A1的同源基因。进化分析发现它们组成了一个新的NR亚家族,命名为NR8亚家族。NR8是第三出现的NR亚家族,起源于真后生动物的共同祖先,并在脊椎动物、蜕皮动物、扁形动物的祖先中分别独立发生了基因丢失事件。对CgNR8A1的功能研究结果表明,CgNR8A1具有核定位信号肽GKHRNKKPRLD,并定位于细胞核。发育过程中的表达模式暗示CgNR8A1可能参与胚胎的形成。EMSA实验显示CgNR8A1能与保守的DNA核心基序DR0、DR2、DR4紧密结合,与DR1、DR3、DR5、Half和Pal0结合较弱。新鉴定的NR8亚家族增加了人们对NR亚家族进化的理解,CgNR8A1的功能鉴定有助于对NR8亚家族功能的理解。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

第一章、文献综述这段短序列组成了一个非对称的二聚接口，并且它的氨基酸序列对区分不同的DRs 有着非常重要的作用(Bourguet, Ruff et al. 1995, Knegtel, van Tilborg et al.1995)。在 DBD 和 LBD 之间的序列最初被认为是多变的铰链区。更加细致的分析该区域发现很多 NRs 都含有核受体定位信号肽段。该区域中与 DBD 和 LBD 衔接的末端也是高度保守的。如，N 端的 T-box 和 A-box 分别参与 NRs 的二聚化和 half-site 的识别。C 端含有的结构域在配体介导的受体与转录调节因子的结合，特别是行驶转录抑制是，起关键作用。铰链区的突变与肿瘤生成相关，说明该区域的作用曾被低估了(Bourguet, Ruff et al. 1995)。

两条 GSP 引物进行扩增。第一轮扩增使用 LaTaq 反应体系和 touchdown 反应程序如下：touchdown 反应程序：94°C 3 min94 °C 30 sTM+2 30 s72 °C 1kb/min94 °C 30 sTM-3 30 s72 °C 1kb/min72 °C 10 min4°C 保温第二轮扩增模板使用稀释了 50 倍的第一次 PCR 产物，LaTaq 反应体系和 LaTaq反应程序。PCR 产物的纯化，连接转化，测序同基因片段的克隆。20 cysles10 cysles, - 0.7°C/cycle

第二章、长牡蛎甲状腺激素及其信号通路关键基因的功能研究然后进行 5’加尾反应。以末端转移酶（TdT）为 cDNA 加尾。5’加尾反应体系：cDNA 10 μldCTP 0.5 ul5×TdT 缓冲液 5.0 ulBSA 缓冲液 6.25 ul灭菌超纯水 2.25 ul反应程序为：94℃冰上放置 3min，，加入 TdT 1μl，混匀 37℃水浴 15min 后，再 65℃水浴 5min，-20℃保存。以 5’加尾后的 cDNA 为模板，用 oligo(dG)-AP 和 AP 引物以及目的基因的两条 GSP 引物进行巢式 PCR 扩增。第一轮和第二轮的反应体系和反应程序及后续的操作都同 3’RACE。
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本文编号：2854795