维甲酸X受体在杂色鲍性腺分化与发育中的调控作用

发布时间：2020-10-24 16:33

　　软体动物性腺分化与发育的分子机制一直以来都是繁殖生物学和水产养殖学的研究重点。尽管软体动物体内存在类似于脊椎动物的雌激素和雄激素,但由于缺乏对其生物合成途径或来源的了解,以及有关激素受体的直接证据,脊椎动物类型的类固醇激素在软体动物性腺分化中的作用尚无定论。近年来,备受关注的腹足类性畸变分子机制的研究表明,维甲酸X受体(retinoid X receptor,RXR)在腹足类性畸变的过程起着重要的作用。有关性畸变分子机制的研究表明RXR对于腹足类性腺分化与发育的作用机制至关重要。本论文采用荧光实时定量PCR技术和RNA干扰技术研究了杂色鲍RXR基因和细胞凋亡相关基因在杂色鲍性腺分化与发育中的作用机制。主要结果如下:1、每月采集雌雄样品,采用常规组织切片和HE染色技术跟踪观察了杂色鲍性腺发育的周年变化。根据杂色鲍性腺的颜色、体积、生殖细胞的形态结构及占主体的生殖细胞的类型等将杂色鲍的性腺发育分为5个时期:休止期、增殖期、生长期、成熟期和排放期。观察结果显示:厦门本地的杂色鲍一年只有一个生殖周期,并且雌性个体和雄性个体的发育是不同步的:雌性杂色鲍性腺发育的休止期是1到3月;增殖期是4到5月;生长期是6到7月;成熟期是8到12月,雄性杂色鲍性腺发育的休止期是2到3月;增殖期是4到5月;生长期是6到10月;成熟期是11月到次年1月。另外,杂色鲍性腺发育的个体差异较大,性腺发育成熟时期会观察到处于生长期或者更早期的个体,因此不同发育时期样品的选择要根据组织学观察的结果而不是取样的时间。2、采用geNorm、Normfinder和Bestkeeper等内参分析软件对10个候选内参基因包括β-action(β-ACT)、18S ribosomal(18S)、28S ribosomal(28S)、elongation factor 1-alpha(ELFA)、ribosomal protein L8(RPL8)、translation initiation factor 5A(EIF5A)、Y-box protein(YB1)、ornithine decarboxylase antizyme 1(OAZ1)、60S ribosomal protein L3(RPL3)、ribosomal protein S9(RPS9)进行分析并筛选了杂色鲍性腺发育过程中不同组织的最适内参基因:杂色鲍性腺发育过程中卵巢内表达最稳定的内参基因是OAZ1;杂色鲍性腺发育过程中雌性杂色鲍头部组织内表达最稳定的内参基因是EIF5A;杂色鲍性腺发育过程中雌性杂色鲍肝胰腺组织内表达最稳定的内参基因是28S;杂色鲍性腺发育过程中雄性杂色鲍头部组织内表达最稳定的内参基因是RPS9;杂色鲍性腺发育过程中雄性杂色鲍肝胰腺组织内表达最稳定的内参基因是EIF5A。3、分析了维甲酸X受体(retinoid X receptor,RXR)在杂色鲍性腺发育过程中不同组织的表达情况:在卵巢、雌性个体头部、雌性个体肝胰腺和雄性个体头部组织中,RXR在性腺发育的增殖期时表达量显著上调(P0.05);在雄性个体肝胰腺组织中RXR在性腺发育的增殖期时的表达量显著下调(P0.05)。结果显示,RXR基因在性腺发育增殖期时的不同组织的表达量与其他发育时期相比均存在显著性差异,这表明增殖期是RXR在杂色鲍性腺分化与发育发挥作用的窗口期。4、本论文还通过实时荧光定量PCR技术研究了细胞凋亡相关基因在杂色鲍性腺分化与发育中的作用:在卵巢中,半胱天冬氨酸酶3(Caspase3,Casp3)和细胞凋亡因子(defender against cell death 1,DAD1)在性腺发育休止期时表达量显著上调(P0.05);类胰岛素生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)和转录因子激活蛋白1(activator protein 1,AP1)在性腺发育增殖期时表达量显著上调(P0.05),表明Casp3、DAD1、IGFBP7和AP1确实参与了卵巢分化与发育过程。5、雌性杂色鲍肝胰腺组织注射RXR基因双链RNA 48h后,雌性杂色鲍头部组织的RXR表达量与空白对照组和绿色荧光对照组相比没有显著性差异;雌性杂色鲍卵巢组织的RXR表达量空白对照组和绿色荧光对照组相比显著性下调。这些结果证明了对杂色鲍进行活体注射双链RNA可以让体内的目的基因产生基因沉默现象。
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

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(c) 生长期 (d) 成熟期图 2.1 雄性杂色鲍性腺发育分期Fig 2.1 Photomicrographs of H.diversicolor developmental stages of the testis2.2.2 卵巢发育的分期卵巢组织处于休止期时卵巢萎缩，生殖上皮随结缔组织迁移到卵巢腔内，腔体积较腔内观察不到生殖细胞，但有一定数量的滤泡细胞（图 3.2a）。增值期的卵巢中，性腺腔积变化不大，腔内的生殖上皮分化出大量的卵原细胞并贴壁分布，形成增值中心，腔壁结缔组织发达（图 3.2b）卵巢发育至生长期时卵巢体积变大，单个的生殖细胞体积也迅的增大，但仍残留少量的早期生殖细胞，腔壁明显变薄（图 3.2c）。卵巢成熟时期，整个巢被成熟的卵母细胞所填充，细胞与细胞相互挤压形成不规则的形状。性腺外观呈褐绿性别肉眼可辨（图 3.2d）。

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(c) 生长期 (d) 成熟期图 2.2 雌性杂色鲍性腺发育分期Fig 2.2 Photomicrographs of H.diversicolor developmental stages of the ovary2.3 讨论组织学切片技术是生物科研中常用到的方法。组织经过 Bouin 氏固定液的固定，各浓度梯度的酒精脱水，二甲苯的透明以及石蜡包埋后用切片机将组织切成不同厚度的片，在经过伊红和苏木精的染色就能观察不同细胞的形态结构和体积。本论文通过一段间的预实验发现，组织学切片技术上的小细节比如选择合适的切片位置，选择合适的切厚度、包埋时烘箱的温度设定、二甲苯透明时的时间选择等应该根据不同的物种甚至同物种的不同组织来做调整。对于软体动物性腺发育的分期，目前国内还没有统一的标准，刘尔云[61]等人根据滤的发育和精卵的成熟度，孙虎山[62]和胡建兴[63]等人依据滤泡的发育和滤泡中生殖细胞的

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