三角帆蚌肽聚糖识别蛋白基因的克隆及表达

发布时间：2020-10-28 17:54

　　 肽聚糖识别蛋白作为一类可识别肽聚糖和含肽聚糖病原菌的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR),在先天免疫防御系统中发挥重要的识别作用和调节功能。本实验克隆了三角帆蚌HcPGRP short、HcPGRP long、HcPGRP S2基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR方法检测三角帆蚌三个基因在三角帆蚌血细胞、肝胰腺、鳃、闭壳肌、外套膜等五种不同组织中的表达,通过PBS、肽聚糖、嗜水气单胞菌的刺激诱导蚌后,检测三个基因在蚌的血细胞、肝胰腺、鳃组织中表达变化。用基因重组技术构建pET30-HcPGRP long及pET30-HcPGRP S2原核表达载体,利用大肠杆菌表达系统进行表达并纯化出蛋白。HcPGRP short基因的全长为1493 bp,开放阅读框为858 bp,编码了 285个氨基酸组成的蛋白质,其中包含5' UTR(非编码区)的长度为127 bp,3' UTR长度为508bp;HcPGRP long基因的全长为1200 bp,开放阅读框为462 bp,编码了 154个氨基酸组成的蛋白质,其中包含5' UTR的长度为334bp,3' UTR长度为404bp;HcPGRP S2基因的全长为1037bp,开放阅读框为657 bp,编码了 219个氨基酸组成的蛋白质,其中包含5' UTR的长度为287bp,3' UTR长度为93bp。这三个基因都含有II型N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶结构域,也称为PGRP结构域。HcPGRP short和HcPGRP S2在蛋白N端都含有信号肽(HcPGRP short:MAALHITTSMSRASVLTAYRLFICFVCARCLLRNVNG;HcPGRP S2:MFQSSFRRLELNCHEPEEITMWLLFLVTLCVLSCEG)和潜在的N-糖基化位点(HcPGRP short:40(NPTH)和 92(NYSC);HcPGRP S2:44(NVTL));HcPGRP short 和 HcPGRP long 都含有跨膜结构域,预测 HcPGRP short为分泌型的跨膜蛋白,HcPGRP long为跨膜蛋白,HcPGRP S2为分泌型蛋白。系统进化树显示三角帆蚌这三个基因与夏威夷短尾鱿鱼EsPGRP4聚为一枝,表明他们之间进化关系密切。多重序列比对显示,HcPGRP short和HcPGRP long中能与Zn2+结合及维持酰胺酶活性位点只有部分保守,HcPGRP S2则高度保守;HcPGRP short和HcPGRP long中能与DAP型PGN特异性结合的三个氨基酸位点高度保守,而HcPGRP S2部分保守。使用荧光定量PCR检测到三个基因在三角帆蚌不同组织中均有表达,且表达量大小有相同的趋势,表达量由高到低依次为肝胰腺、鳃、外套膜、闭壳肌、血细胞。其中HcPGRP short在肝胰腺的表达量为血细胞的6.61倍;HcPGRP long在肝胰腺的表达量为血细胞的11.29倍;HcPGRP S2在肝胰腺的表达量为血细胞的4.95倍,而HcPGRP long在各组织的表达量均是这三个基因中最低的。经肽聚糖和嗜水气单胞菌刺激后,除了 HcPGRP long基因在血细胞中无显著的表达差异,这三个基因各自在血细胞、肝胰腺和鳃各组织中都有表现出显著或极显著的表达差异。这三个基因通过嗜水气单胞菌刺激后分别在这三个组织中的某时刻表达量都表现出显著或极显著高于PBS刺激,而通过肽聚糖刺激后只在部分组织出现表达量显著高于PBS刺激。通过质粒 pET-30 建立重组质粒 pET30-HcPGRP long 和 pET30-HcPGRP S2在诱导破碎后发现以包涵体的形式存在,HcPGRP S2的包涵体经变性复性后纯化得到了有活性的可溶性重组蛋白,HcPGRP long经变性后纯化得到可溶性重组蛋白。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

?直接相连，而Ｌｙｓ型ＰＧＮ肽桥的变化较多，前后两肽尾Ｄ－Ａｌａ与Ｌ－ｌｙｓ中间连??有一段细菌之间所特异的间桥肽（ｉｎｔｅｒｐｅｐｔｉｄｅ?ｂｒｉｄｇｅ）（图１．１）。除了这些分??类根据外，ＰＧＮ结构的多样性也与ＰＧＮ的交联程度的差异相关［１（）］［１２］［１３］。??（？）?ｗ??Ｈ０Ｈ２Ｃ?ＨＯＨ２Ｃ??ＮＨ?｜?ＮＨ?ＨＣ－－Ｃｈ３?｜??ＣＯ?Ｉ?＊?ＣＯ??？°?？°?Ｉ?？°?ｆ°?Ｉ??ｔ．?ＣＨａ?Ｉ?ＣＨ３??Ｌ?ＣＨ３?卞?」ｎ?Ｌ?ＣＨ３?卞?３ｎ??ｏ－ｉＳ｜－ＧＪｎ?ｏ－ｉｓ｜－Ｇｌｕ??ｉ－＇ｙｓ?＊？—（ｎ?ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄｓ）?—ｏ－Ａｌａ?ｍ－ｐａｐ－＊?ｏＡｌａ??ｏ－Ａｆａ?ｔ？Ｌｙｓ?〇－Ｍａ?ｎｖＤａｐ??ｏ－ｉｓｐ－ＧＩｎ?ｏ－ｔｓｐ－Ｇｌｕ??ｔ＾ａ?ｔ－Ｍａ??ｔ?ｔ???ＧＩｃＮＡｃ?｜Ｍ．４?ＭｕｒＮＡｃ￣－?—??ＧＩｃＮＡｃ?１＞－１，４?ＭｕｒＮＡｃ＊——?＿??Ｊｎ?Ｊｎ??图１．１?Ｌｙｓ型和Ｄａｐ型ＰＧＮ结构示意图??图１．１?Ｌｙｓ和Ｄａｐ型ＰＧＮ结构??Ｆｉｇ?１．１?Ｓｔｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?Ｌｙｓ－ｔｙｐｅ?ａｎｄ?Ｄａｐ－ｔｙｐｅ?ＰＧＮ??ＰＧＮ作为细菌细胞壁的组成成分重要而独特，主要存在于革兰氏阳性细菌??中［１２］，在细菌的生存中发挥着至关重要的作用，它是很多临床上所用的抗生素??的作用靶标，它以阻断细菌细胞壁的合成来达到抑菌效果［１２］，而ＰＧＮ是所有细??菌特有的成分而不存在于真核细胞中

液体培养基中，在转速为２００?ｒｐｍ温度为３７?°Ｃ振荡８ｈ，同样方法再进行扩大培??养，然后用普通质粒小提试剂盒提取质粒。载体的多克隆位点的序列和结构图??谱如图２．３。??回收产物和表达质粒ｐＥＴ３０－ａ?（＋）分别用限制性内切酶ＨｃＰＧＲＰＳ２：?Ｋｐｎｌ??和ＥｃｏＲＩ；?ＨｃＰＧＲＰ?ｌｏｎｇ：?ＥｃｏＲＩ和Ｘｈｏｌ）进行双酶切，酶切体系为２〇ｎＬ?（１０吣??ＤＮＡ或质粒，６吣Ｈ２０，?２ｍＬｌ〇ｘＨ?ｂｕｆｆｅｒ，限制性内切酶各为ｌｊｉＬ），３７°Ｃ?４ｈ。??酶切后分别对酶切产物用普通ＤＮＡ产物纯化试剂盒进行纯化。??将两种酶切产物用Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行连接，为ＩＯｊｉＬ的连接体系，包括：??４ｐＬＤＮＡ，４吣质粒，ｌｐＬＴ４ＤＮＡ连接酶，１吣连接ｂｕｆｆｅｒ，放于４°Ｃ冰箱中??连接过夜。次日取连接产物５叫转化至ＤＨ５ａ感受态细胞中，涂平板后培养，??约１０ｈ后挑取单个菌落，ＰＣＲ检测后取阳性菌液５００１ｎＬ送测。??按１：?５０的比例将测序正确的菌液加入到Ｋａｎａ＋?ＬＢ培养基扩培，３７°Ｃ，??２００ｒｐｍ振荡培养８ｈ

３．２基因的ｃＤＮＡ全长及氨基酸序列??３．２．１?ＨｃＰＧＲＰ?ｓｈｏｒｔ基因的ｃＤＮＡ序列及推导的氨基酸序列??ＨｃＰＧＲＰ?ｓｈｏｒｔ核苷酸序列及推导的氨基酸序列如图３．２，其全长为１４９３?ｂｐ，??开放阅读框长度为８５８ｂｐ，编码的蛋白质是由２８５个氨基酸组成，其中包含３’??１１〇１长度为５（＾？，５’１１丁１１（非编码区）长度为１２７?５？；含有多聚腺苷酸尾０〇以??（Ａ）和１个ＡＡＴＡＡ加尾信号；并在该蛋白Ｎ端有一个长度为３７个氨基酸的??信号肽（ＭＡＡＬＨＩＴＴＳＭＳＲＡＳＶＬＴＡＹＲＬＦＩＣＦＶＣＡＲＣＬＬＲＮＶＮＧ）。该蛋白分子??量为３２．３３ｋＤ，理论等电点为７．９８，１１个半胱氨酸残基存在于氨基酸序列中。??ＮｅｔＮＧｌｙｃ预测三角帆蚌ＰＧＲＰ?ｓｈｏｒｔ含有两个潜在的Ｎ－糖基化位点为４０??（ＮＰＴＨ）和９２?（ＮＹＳＣ）。Ｐｆａｍ?ＨＭＭ分析其蛋白序列，发现在Ｃ端于１２５－２６１??氨基酸位点存在长度为１３７个氨基酸的ＩＩ型Ｎ－乙酰胞壁酸－Ｌ－丙氨酸酰胺酶结构??域，也称为ＰＧＲＰ结构域。??１?ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＧＣＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧ??６１?ＧＣＴＧＴＧＴＣＣＧＴＴＣＡＴＣＧＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＴＴＡＣＡＣＡＴＴＡＡＧＡＣＡＴＣＧＣＡＧＴＴＴＣＡＡＣＧＣＡＴＴ??１２１?ＧＡＧＣＴＴＡ＾ＧＣＧＧＣＣＴＴＡＣＡＴＡＴＡＡＣＣＡＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＧ
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本文编号：2860412