低温胁迫下东北林蛙GS、Akt2基因表达与分析

发布时间：2020-10-30 13:40

　　 东北林蛙(Rana dybowskii)在我国主要分布于东北地区,该地区处于亚寒带,长达6个月的冬眠期对东北林蛙的生存造成极大的威胁。本实验室前期研究表明东北林蛙在低温状态下机体积累大量葡萄糖作为抗冻保护物质抵御低温伤害。糖原合成酶(glycogen synthase,GS)是糖原合成限速酶,直接参与糖原合成与分解过程。丝/苏氨酸激酶(Serine/threonine kinases,Akt)作为胰岛素信号通路上的重要激酶,不仅参与糖代谢调节,而且在机体受到低温因素刺激时抑制细胞凋亡。本实验主要研究东北林蛙在低温状态下GS和Akt2 mRNA表达量变化,为探明机体如何产生高糖且耐高糖机制奠定基础。本实验以东北地区两栖类优势代表物种东北林蛙为研究对象,设4℃为对照组,-1℃为实验组,进行低温胁迫,分别在胁迫4h、8h、12h、24h、48h、72h时间点对其心脏、肝脏和骨骼肌取样,提取总RNA。采用PCR技术及RACE法克隆东北林蛙GS和Akt2基因序列,并对其进行蛋白结构分析;采用q PCR技术检测GS和Akt2 mRNA表达,探究其在低温过程中的动态变化。实验结果:RACE法获得东北林蛙GS基因全长2855bp,开放阅读框2214bp,编码737个氨基酸;东北林蛙Akt2基因全长1976bp,开放阅读框1461bp,编码486个氨基酸。qPCR检测显示低温胁迫下东北林蛙GS mRNA在心脏、肝脏、骨骼肌中表达水平均呈显著下调(p0.05),其中,心脏在8h降至最低,为对照组的9%,24h时基本恢复;在肝脏和骨骼肌则持续呈低水平表达,均在4h降至最低,分别为对照组的17%和4%。低温胁迫下东北林蛙Akt2 mRNA表达水平在心脏、肝脏中均呈显著上调(p0.05),12h达高峰,其中,心脏和肝脏分别为对照组的4.4倍和4.6倍,72h时基本恢复正常;而骨骼肌则变化不显著。本研究首次获得东北林蛙GS和Akt2的基因全长序列,并对低温胁迫下东北林蛙GS和Akt2分子的时空表达变化进行了分析,结果显示GS mRNA表达显著下调,Akt2mRNA表达显著上调,为进一步探索东北林蛙低温糖代谢相关研究提供理论依据。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.4
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 绪论
    1.1 变温动物耐低温机制
        1.1.1 耐寒性
        1.1.2 耐冻性
        1.1.3 低温代谢调节
        1.1.4 抗冻保护剂
        1.1.5 代谢相关酶的调节
    1.2 胰岛素信号通路及其相关的重要因子
        1.2.1 胰岛素与胰岛素信号通路
        1.2.2 PI3K与PDK1
        1.2.3 Akt/PKB
        1.2.4 GSK3β 与GS
    1.3 东北林蛙
    1.4 蛙类低温生理学研究
    1.5 本实验研究目的及意义
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 GS、Akt2 mRNA序列及引物设计
        2.2.2 低温胁迫
        2.2.3 组织总RNA提取
        2.2.4 cDNA合成
        2.2.5 RACE法获得东北林蛙GS、Akt2基因全长cDNA序列
        2.2.6 东北林蛙GS、Akt2基因全长cDNA序列的生物信息学分析
        2.2.7 mRNA表达水平的检测
    2.3 本章小结
3 结果与分析
    3.1 东北林蛙总RNA提取
    3.2 东北林蛙GS、Akt2 cDNA基因序列全长及蛋白分析
        3.2.1 东北林蛙GS、Akt2基因全长克隆及结构分析
        3.2.2 东北林蛙GS、Akt2氨基酸与其他物种序列同源性比较
        3.2.3 东北林蛙GS、Akt2蛋白一级结构预测
        3.2.4 东北林蛙GS、Akt2磷酸位点分析
        3.2.5 东北林蛙GS、Akt2编码氨基酸的信号肽预测
        3.2.6 不同物种间GS、Akt2蛋白多重序列比对
    3.3 东北林蛙GS、Akt2的基因表达分析
        3.3.1 引物特异性验证
        3.3.2 东北林蛙GS、Akt2的扩增溶解曲线
        3.3.3 东北林蛙GS、Akt2 mRNA表达分析
    3.4 本章小结
4 讨论
    4.1 抗冻物质葡萄糖
    4.2 东北林蛙GS结构与功能
    4.3 东北林蛙GS低温胁迫表达变化
    4.4 东北林蛙Akt2结构与功能
    4.5 东北林蛙Akt2低温胁迫表达变化
结论
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢

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本文编号：2862548