拟穴青蟹C型凝集素基因的克隆及表达分析

发布时间：2020-10-30 14:13

　　 C型凝集素是指具有一个或多个钙依赖型碳水化合物识别结构域(CRD)的动物凝集素,存在于几乎所有后生动物中,在先天免疫和适应性免疫中都发挥重要作用。在脊椎动物中,C型凝集素是保守的,大多数仅含有一个碳水化合物识别结构域,而无脊椎动物的C型凝集素类型更加多样化,功能也更复杂,对无脊椎动物C型凝集素的研究有助于先天免疫机制的阐明,能够丰富C型凝集素家族的研究。拟穴青蟹是我国重要的养殖蟹类,主要分布在长江以南的东南沿海地区,但人工养殖中蟹苗存活率低,细菌或病毒感染会加重这一情况。拟穴青蟹属于无脊椎动物,仅具有先天性免疫系统,研究青蟹的先天免疫机制以提高其自身免疫力对于生产具有十分重要的意义。本研究获得了三条拟穴青蟹C型凝集素基因,并对青蟹进行病原胁迫实验,利用实时荧光定量技术对其进行表达模式分析,获得了以下成果:1.通过RACE法成功克隆得到了拟穴青蟹一种含CTLD结构域的C型凝集素基因,将其命名为SpCTLD。该基因cDNA序列全长为1237bp,包含一个468bp的开放阅读框,编码155个氨基酸,预测分子量为18.32KDa,等电点为7.56。该基因在第390位(A390G)和第1020位(T1020C)含有两个SNP位点。对SpCTLD在拟穴青蟹幼体不同时期和组织中的表达模式分析发现,SpCTLD在幼体的各个发育时期均有表达,其中在溞状幼体Ⅴ期表达量最高,仔蟹Ⅰ期次之,仔蟹Ⅱ期最低。对SpCTLD的组织分布分析表明,鳃中表达量最高,其次为射精管,二者表达量远远高于其它组织,在血淋巴、肝胰腺等其他免疫相关组织中也有表达。副溶血弧菌胁迫实验表明,活菌组的肝胰腺、血淋巴、鳃中mRNA表达量发生明显上调,且都在第12小时达到最高。根据本研究结果推测SpCTLD是一种含CTLD结构域的新基因,它可能参与了拟穴青蟹抗细菌反应。该基因的发现丰富了拟穴青蟹C型凝集素相关基因的研究,有利于完善甲壳动物先天免疫机制的研究。2.本研究获得了拟穴青蟹另外两条C型凝集素基因:SpMR和SpCollectin-12-like。SpMR基因的cDNA序列全长为1762bp,包含一个936bp的开放阅读框,编码311个氨基酸,还包括一个258bp的5′UTR和一个568bp的3′UTR。预测其分子量为35.4KDa,等电点为4.12,含有一个长18个氨基酸的信号肽。编码区存在两个C型凝集素样结构域(CTLD),分别为第30到第157个氨基酸和第180到307个氨基酸,在此区域内各含有一个保守识别基序EPN和WND。SpCollectin-12-like的cDNA全长为2293bp,包含一个819bp的开放阅读框,编码272个氨基酸,含有一个346bp的5′UTR和一个1128bp的3′UTR。预测其分子量为29.8KDa,等电点为6.09,含有一个长24个氨基酸的信号肽。编码区存在一个CTLD结构域,为第143-266个氨基酸,在此区域内含有一个保守识别基序WND。通过副溶血弧菌胁迫实验,初步证明二者参与了拟穴青蟹的抗细菌免疫反应。本研究丰富了C型凝集素在拟穴青蟹先天免疫中的研究,有助于推动相关免疫增强剂的开发,对于完善甲壳动物先天免疫机制的研究有积极意义,有利于水产养殖行业的健康发展。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

CTLD的结构

上海海洋大学硕士学位论文两个 SNP 位点（A390G,T1020C），开放阅读框为 468bp，编码 155 个氨基酸外还有 82bp 的 5′ UTR 和 687bp 的 3′ UTR，在 3′ UTR 区域含有典型的加尾AATAAA（图 2.1）。预测其蛋白分子量为 18.32kDa，等电点为 7.56。TargetServer 和 Mitoprot 预测该蛋白定位于线粒体，含有信号肽，为分泌蛋白，该预靠性等级为 1（最高等级可信度）。线粒体靶向序列为第 1 到 14 个氨（MAPSRPLVLLTVLL），切割位点为第 15 个氨基酸（S）。信号肽预测为到 21 个氨基酸，信号肽 N 端为第 1 到 6 个氨基酸，疏水核心区为第 7 到 16基酸，C 端为第 17 到 21 个氨基酸。配体结合位点为 124E, 128A, 130N, 136K, 139S, 140E, 141Y, 144D, 145Y, 146K。结构域 CTLD 位于第 26 到第 151 个氨基在第 89-91 个氨基酸出现了 Ca2+特征性识别基序 LND。

2.2.2 SpCTLD 在拟穴青蟹幼体和组织中的表达从溞状幼体 I 期到仔蟹Ⅱ期，SpCTLD 在拟穴青蟹幼体各个时期均有表2.2），并且整体表达量较高。从 Z1 期到 Z4 期整体表达量较为稳定，至 Z到最高点，而后至 M 期和 C1 期略有下降，C2 期表达量大幅下降，远远低时期，达到最低点。qPCR 检测 SpCTLD 在拟穴青蟹不同组织中的表达结果显示，SpCTLD 测的 12 个组织（血淋巴 HE、肝胰腺 HEP、眼柄 ET、射精管 ETU、精巢 T肉 MU、鳃 GI、心脏 H、大触角 ATA、小触角 ATU、Y 器 YO、表皮 CU）表达（图 2.3），其中在鳃中表达量最高，射精管次之，且两者的 mRNA 表远高于其他组织。肝胰腺、表皮、大触角、小触角、血淋巴、肌肉这几个表达量比较接近，但远低于鳃和射精管。心脏、Y 器、眼柄以及精巢的 mR达量较为接近，呈现显著低表达（P<0.05）。
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本文编号：2862589