拟穴青蟹三种组织蛋白酶的免疫应答特性、酶学性质及其促细胞凋亡功能研究

发布时间：2020-10-31 11:09

　　 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海地区重要的海水养殖蟹类,具备高营养价值和经济价值,但在养殖过程中容易遭受各种病害侵袭。近几年来,为了更好地进行病害防治,人们对青蟹自身免疫机制的研究逐渐增多。组织蛋白酶是一类溶酶体蛋白酶,广泛参与机体的各种生理过程,包括细胞内蛋白质降解、酶原和激素原的激活、免疫调节、炎症反应、细胞外基质重塑等,因此探索拟穴青蟹组织蛋白酶的功能特性对于深入了解甲壳动物先天性免疫防御机制具有重要意义。目前对于组织蛋白酶的研究多集中于哺乳动物,而对于无脊椎动物尤其是甲壳动物组织蛋白酶的研究还非常少。本课题组在前期研究工作中利用拟穴青蟹胚胎转录组筛选获得组织蛋白酶B、L、D的同源基因片段,分别命名为SpCathB、SpCathL和SpCathD。本论文主要研究成果如下:1.克隆获得了 SpCathB、SpCathL、SpCathD 的开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列并进行生物信息学分析。三种组织蛋白酶的一级结构都是由信号肽、前体肽和成熟肽组成,其中SpCathB和SpCathL属于半胱氨酸蛋白酶而SpCathD属于天冬氨酸蛋白酶。SpCathBORF序列全长999bp,编码322个氨基酸残基,预测有三个半胱氨酸蛋白酶活性位点;SpCathLORF序列全长1029bp,编码342个氨基酸残基,预测有三个半胱氨酸蛋白酶活性位点;SpCathD ORF序列全长1158 bp,编码385个氨基酸残基,预测有两个天冬氨酸蛋白酶活性位点和一个非消化性组织蛋白酶D特征序列。2.揭示了 SpCathB、SpCathL、SpCathD在正常机体的组织分布特性以及在机体受到副溶血弧菌和LPS感染后的基因表达变化模式。结果表明SpCathB、SpCathL、SpCathD的表达特性十分相似,在正常雌、雄蟹所采集的各个组织中均有不同程度的表达,其中肝胰腺和中肠的相对表达量较高。在机体遭受副溶血弧菌感染或LPS刺激后,SpCathB、SpCathL、SpCathD在肝胰腺、中肠和血淋巴细胞三个组织中的表达量均呈现显著下调趋势,说明拟穴青蟹组织蛋白酶可能参与机体免疫反应。3.获得了纯化的真核表达proSpCathL蛋白并测定其酶学性质。利用毕赤酵母表达系统对proSpCathL进行真核表达,利用镍离子金属螯合亲和层析获得其纯化蛋白,研究结果表明proSpCathL表达产物在酸性条件下能够自催化形成约30 kDa的成熟肽。酶活性测定结果证明表达产物具有组织蛋白酶L活性,且测得最适pH为pH 5,最适温度为30℃。4.初步探索了 SpCathB、SpCathL、SpCathD在细胞凋亡中的作用。共定位实验结果表明,SpCathB、SpCathL、SpCathD在转染入昆虫细胞后均能进入溶酶体。TUNEL检测结果表明,单独转染SpCathB、SpCathL、SpCathD不能直接诱导昆虫细胞凋亡,但将Sp-caspase与SpCathB、SpCathL、SpCathD分别共转染后细胞凋亡的现象增多,说明这三个蛋白可能具有促进细胞凋亡的作用。细胞外实验证明,SpCathL只能降解Sp-caspase蛋白,但不能对其进行催化激活,推测拟穴青蟹组织蛋白酶可能通过其他途径对细胞凋亡产生调节作用。综上,本研究一方面对SpCathB、SpCathL、SpCathD进行了基础的鉴定工作和基本特性研究,包括基因克隆、生物信息学分析、组织分布、细胞内定位、真核表达和酶学性质研究,另一方面对这三个基因在免疫应答和细胞凋亡方面的功能进行了初步探索,发现这三个基因都能够参与机体的免疫响应,并且能够促进细胞凋亡,证明SpCathB、SpCathL、SpCathD是拟穴青蟹体内重要的免疫因子,这为深入研究组织蛋白酶和无脊椎动物免疫系统奠定了理论基础。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

由于组织蛋白酶原可以进行Ｎ－连接糖基化形成甘露糖残基，随后在高尔基??体内发生磷酸化形成６－憐酸甘露糖（Ｍａｎｎｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，?Ｍ６Ｐ），因此可以通??过Ｍ６Ｐ受体通路转运至核内体和溶酶体中［７］（图１－１）。??工、‘?＝＾?Ｉ??｜?Ｗｇｈ－ｍａｎｒｏ＆ｅ?ｇ＾ｙｃａｎ??Ｓ?Ｓ?（?１??ＥＨＪ??＿＿．?．ｐｌ＾ａ??Ｘｓ，ｅｅ—????＿■?＿?Ａｃｔｉｖｅ?ｓｉｔｅ?＿?＇??Ｅａｒ４ｙ?ｅｆｉｄｏｓｏｍｅ?Ｌｙｓｏｓｏｍｅ??图１－１组织蛋白酶Ｌ的转运途径【７】??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ?ｏｆ?ｃａｔｈｅｐｓｉｎ?Ｌ??２??

除了适应性免疫以外，组织蛋白酶还参与机体的先天性免疫，不仅配合溶酶??体参与细胞吞噬和细胞自噬，还能调节细胞凋亡、Ｔｏｌｌ样受体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ，??ＴＬＲ）信号通路以及炎症反应等过程（图１－２），其中细胞凋亡功能会在本章第??３节中详细介绍。Ｔｏｌｌ样受体是一类模式识别受体，能够识别微生物中具有保守??结构的分子并启动免疫响应。研宄表明，组织蛋白酶Ｂ、Ｋ、Ｌ、Ｓ和Ｆ能够切??割ＴＬＲ９［２３，２４１。尽管ＴＬＲ９全长蛋白和切割后的ＴＬＲ９蛋白都能与病原微生物的??４??

第１章绪论??细胞色素Ｃ向胞质的释放，而这一步骤主要受Ｂｃｌ－２家族蛋白调控细胞色素??Ｃ在细胞质中能激活衔接蛋白Ａｐａｆ－１，而活化的Ａｐａｆ－１又能聚集并激活??ｃａｓｐａｓｅ－９，从而形成由细胞色素Ｃ、Ａｐａｆ－１和ｃａｓｐａｓｅ－９组成的调亡酶体，最终??激活效应ｃａｓｐａｓｅｓ从而导致细胞凋亡［３９］。外源性途径又称作死亡受体途径，由??ＴＮＦ超家族成员中的跨膜受体蛋白（如Ｆａｓ、ＴＮＦＲ１等）与相关配体（如ＦａｓＬ、??ＴＮＦ－ｏｔ等）特异性结合，诱导寡聚化和构象变化从而聚集衔接蛋白，引发下游??ｃａｓｐａｓｅｓ蛋白的活化导致细胞凋亡的发生［４０】。通常认为，内源性细胞凋亡由某些??刺激物如病原微生物、福射、活性氧分子（Ｒｅａｃｔｉｖｅ?ｏｘｙｇｅｎ?ｓｐｅｃｉｅｓ，?ＲＯＳ）、错??误折叠蛋白的累积等引发，而外源性细胞凋亡则是在个体发育、变异和细胞重构??时发生Ｈｉ］。??
【参考文献】

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本文编号：2863866