igf1和trim63a基因在泥鳅二倍体与四倍体中的克隆及表达差异研究

发布时间：2020-10-31 09:33

　　 泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)是我国重要的淡水经济鱼类,因其营养丰富、肉质鲜嫩深受欢迎,仅靠捕捞野生资源无法满足市场需求量,但是泥鳅的体型较小,生产量较低,随着国内泥鳅养殖规模的扩大,如何提高其养殖生产量成为越来越多学者的研究重点。本研究通过对泥鳅二倍体和四倍体不同组织和不同胚胎发育时期胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor,igf1)及肌肉环状指基因1a(tripartite motif containing,trim63a)的基因表达量及雌二醇处理后两种倍性泥鳅不同组织中igf1与trim63a的表达模式变化的研究,探讨igf1、trim63a参与泥鳅二倍体与四倍体肌肉蛋白代谢与生长的调控机理,为泥鳅新品种的培育提供理论基础。本研究主要结果如下:1.克隆得到泥鳅二倍体与四倍体igf1基因的cDNA序列,经比对发现二倍体与四倍体igf1基因的cDNA序列基本一致,氨基酸序列完全一致。生物信息学分析显示,泥鳅二倍体igf1 cDNA序列大小为692 bp,包含483 bp ORF,编码160个氨基酸,氨基酸序列比对结果显示Igf1的氨基酸结构具有高度保守性,与斑马鱼氨基酸序列最为相近;系统进化分析发现,该基因与传统进化的分类地位一致。采用荧光定量PCR技术检测人工繁殖获得的泥鳅二倍体和四倍体胚胎不同发育时期以及二倍体与四倍体成鱼不同组织中igf1 mRNA的表达量。基因表达分析结果显示,igf1在泥鳅二倍体与四倍体胚胎的13个发育时期均有表达,不同倍性的胚胎表达差异较大,igf1在二倍体胚胎的受精卵期表达量显著高于其他胚胎发育时期,在四倍体胚胎的出膜期表达量显著高于其他胚胎时期。igf1在四倍体胚胎4-8细胞期的表达量显著高于二倍体,在肌肉效应期的表达量显著低于二倍体。igf1在泥鳅二倍体与四倍体成鱼的7个组织中均有表达,igf1在肝脏中的表达量显著高于其他6个组织,其次是肌肉。研究表明,igf1在泥鳅二倍体与四倍体的胚胎发育过程中可能发挥重要作用,但其调控机制不同,在二倍体与四倍体成鱼组织中的表达模式相似,可能具有参与调节机体生长的相似功能。2.克隆获得泥鳅二倍体与四倍体trim63a基因的cDNA序列,经比对发现二倍体与四倍体trim63a基因的cDNA序列基本一致,氨基酸序列完全一致。进行生物信息学分析结果显示,泥鳅二倍体trim63a cDNA序列大小为1035 bp,编码344个氨基酸,氨基酸序列比对结果显示Trim63a的氨基酸结构具有高度保守性,与斑马鱼氨基酸序列最为相近;系统进化分析发现,该基因与传统进化的分类地位一致。采用荧光定量PCR技术检测人工繁殖获得的泥鳅二倍体和四倍体胚胎不同发育时期以及二倍体与四倍体成鱼不同组织中trim63a mRNA的表达量。基因表达分析结果显示,trim63a在泥鳅二倍体与四倍体胚胎的13个发育时期均有表达,不同倍性的胚胎表达差异较大,trim63a在神经胚期的表达量显著高于其他胚胎发育时期。trim63a在四倍体胚胎4-8细胞期的表达量显著低于二倍体,在肌节出现期期的表达量显著高于二倍体。trim63a在泥鳅二倍体与四倍体成鱼的7个组织中均有表达,trim63a在肌肉和心脏中的表达量显著高于其他5个组织。研究表明,trim63a可能参与调节泥鳅二倍体与四倍体胚胎发育时期肌肉代谢,在二倍体与四倍体成鱼组织中的表达模式相似,且具有组织特异性,可能具有参与肌肉分解途径的相似功能。3.采用腹腔注射处理泥鳅二倍体与四倍体成鱼,并采用荧光定量PCR技术检测在注射17β-雌二醇(17β-estradiol,17β-E_2)后不同时段(6 h、12 h、24 h、14 d)心脏、肝脏、肌肉和血液igf1和trim63a mRNA的表达变化。结果表明,17β-E_2在泥鳅二倍体与四倍体成鱼中的效应时间不一致,但注射后肌肉和血液中的igf1 mRNA表达量显著上调,肝脏和肌肉中的trim63a mRNA表达量显著上调。注射两周后各组织中igf1和trim63a mRNA的表达量基本恢复正常水平,表明17β-E_2可能已经被鱼体代谢。综上所述,泥鳅二倍体与四倍体中igf1和trim63a均参与调控肌肉蛋白代谢过程,肌肉代谢与机体生长具有较高的相关性,因此,探究泥鳅二倍体与四倍体中igf1和trim63a的表达模式有利于掌握泥鳅肌肉生长的规律,为今后培育生长较快的泥鳅提供理论基础。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

3.1 泥鳅二倍体与四倍体 igf1 基因序列比对本实验采用克隆的方法获得了泥鳅二倍体与四倍体 igf1 基因的 cDNA 序列，通过Blast比对发现泥鳅二倍体与四倍体igf1基因cDNA序列相似度为99.86%（图2-1），氨基酸序列相似度为 100%（图 2-2）。

图 2-1 泥鳅二倍体与四倍体 igf1 基因 cDNA 序列比对Fig. 2-1 The alignments of igf1 cDNA sequences in diploid and tetraploid M. Anguillicaudatus2N：二倍体；4N：四倍体；“*”表示相同的核苷酸序列。2N: Diploid; 4N: Tetraploid; Consensusnucleotides are indicated with asterisks “*” .

华中农业大学 2019 届硕士研究生学位论文倍体 igf1 基因序列信息倍体 igf1 基因 cDNA 序列长 692 bp，ORF 为 483 bp，编码 160 区（5 UTR）102 bp（图 2-3），Expasy Protparam 结果显示 Ig推测蛋白分子式为C768H1217N239O228S15，分子量为17.93 kd，等电er）含量最高为 10.0%，异亮氨酸（Ile）和色氨酸（Trp）含量最低残基（Asp + Glu）总数为 13，带正电荷的残基（Arg + Lys）总结果显示该蛋白无跨膜区；Signal P 4.1 server 结果显示该蛋）；NetPhos 3.1 结果显示该蛋白包含 14 个丝氨酸磷酸化位点、和 1 个酪氨酸磷酸化位点；NetOGlyc 4.0 Server 结果显示该蛋化位点；SMART 结果显示该蛋白含有 1 个功能域即 ILGF（47-ISS-MODEL 预测该蛋白三级结构如图 2-5 所示。
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本文编号：2863771