基于高通量测序的三角帆蚌生物矿化形成珍珠的分子基础研究

发布时间：2020-11-01 00:23

　　 在中国淡水珍珠养殖产业中,高产低值现象十分严重,急需提高我国淡水珍珠颗粒大小和品质,进而提升珍珠养殖效益,这也符合水产养殖转型升级与绿色高质量发展的要求。外套膜作为首选的育珠部位,空间小、组织薄,限制了大核珍珠的培育。而内脏团不仅具有培育大型有核珍珠的空间条件,也具备育珠的生化条件。本论文围绕内脏团是否具有培育优质大型有核珍珠的分子条件这一问题,通过多组学分析手段,从mRNA与蛋白水平挖掘了外套膜与内脏团珍珠培育进程中Ca~(2+)代谢及基质蛋白的分子资源。本文比较三角帆蚌外套膜和内脏团育珠进程中生物矿化相关基因和蛋白的差异表达,并对三角帆蚌珍珠形成过程中重要的基因VDCC(电压依赖性钙通道蛋白)和CABP(钙结合蛋白)进行验证和功能分析。该研究为提升内脏团培育优质大型有核珍珠技术奠定了理论基础。研究如下:1.基于Illumina技术测序平台,利用双末端测序(Paired-End)的方法构建了外套膜的转录组文库,数据经过滤和拼接后,得到257457条Unigenes,与Nr、Nt、Pfam、Swissprot、KO、GO和KOG等数据库进行比对,共注释223345条Unigenes,注释率达到86.7%。从注释的Unigenes中筛选并构建了珍珠形成和生长相关钙代谢和基质蛋白两大模块的基因库。Ca~(2+)代谢基因1235条,其中直接与生物矿化相关基因415条;基质蛋白426条,其中与贝壳和珍珠形成直接相关的基质蛋白97条。2.通过高通量RNA-seq技术、数字表达谱(Digital gene expression,DGE),分析了三角帆蚌外套膜与内脏团育珠进程的基因表达差异。数据分析结果显示,外套膜和内脏团之间的基因表达存在显著性差异,以插核后20天(20thd)的差异表达基因数最多,其次是插核后120天(120 thd),未插核时基因表达也有较大差异,以插核后50天(50 thd)的差异表达基因数最少;Ca~(2+)代谢的差异表达基因数也表现出相同的趋势;基质蛋白的差异表达基因以120 thd最多,50thd最少。外套膜和内脏团分别与对照组比较结果显示,随着育珠时间的延长,外套膜的差异表达基因数逐渐上升,而内脏团则是先升后降;Ca~(2+)代谢和基质蛋白的差异表达基因数量和种类不同。3.采用iTRAQ技术测定了三角帆蚌外套膜外膜、外套膜内膜、珍珠囊和内脏团蛋白质图谱,共鉴定肽段11522个、蛋白1871个。数据分析结果显示,样品间的总差异蛋白数和Ca~(2+)代谢相关差异蛋白表现出相同的规律,内脏团与其它三个样品间(外套膜外膜、外套膜内膜和珍珠囊)的差异蛋白数都比较多,内脏团与珍珠囊之间的差异蛋白最少,外套膜外膜和内膜之间的差异蛋白也较多。KEGG数据库共注释241个pathways,以代谢通路(Metabolic pathways)的基因最多,与珍珠形成密切相关的钙信号通路(Calcium signaling pathway)中,钙调蛋白(CAML)、VDAC(线粒体外膜通道蛋白)、CaN(钙调磷酸酶)、CAMK(钙/钙调素依赖性蛋白激酶)等蛋白上调表达。从注释数据中筛选与钙代谢相关的蛋白包括钙结合蛋白(CABP)、钙调蛋白(CAM)、钙黏蛋白(Cadherin)、内质网钙通道蛋白(RYR)、电压依赖性钙通道蛋白(VDCC)等,筛选与钙代谢相关的基质蛋白包括母系蛋白家族蛋白1(matrilin-1)、N66、和凝集素样蛋白1(ASL1)。4.对筛选的钙代谢相关基因VDCC和CABP进行验证和功能分析。VDCC的cDNA全长1453bp,ORF从439-1053bp,编码204个AA,系统进化树分析显示三角帆蚌的VDCC基因序列与其他水生生物同源性较低。差异表达分析显示珍珠的培育对VDCC基因表达有影响,呈增长的趋势,但差异不显著。CABP的cDNA序列564bp,BLAST分析显示该基因片段与帝国蛤蜊(Pseudocardium sybillae)及菲律宾缀锦蛤(Tapes philippinarum)的CABP基因相似性最高。差异表达分析显示,CABP基因以外套膜组织表达量最高,鳃组织表达量最低。育珠状态下除鳃组织外,其他组织的表达量均有增加趋势,外套膜内、外组织间的增长水平达到了显著水平(P0.05)。不同浓度的Ca~(2+)孵育,CABP基因表达量随着Ca~(2+)孵育浓度的增加而增加。相关分析结果显示,CABP基因的mRNA表达水平与胞外Ca~(2+)流量有显著的负相关(R=-0.993;P0.05),与胞内Ca~(2+)荧光强度间有显著强的正相关(P0.05)。综合以上内容,本研究认为内脏团具有育珠的分子条件;但与外套膜相比,基础代谢不同,育珠过程中的分子调控模式不同。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

clean reads 拼接起来→将 Trinity 与 GICL、cdhit 结源基因聚类分析得到的整合基因集→最后获得了比例最低的 Unigene序列。学分析列与数据库比对注释，在 Unigene 序列差异表达法包括 GO分类分析以及 KEGG富集性分析。e 序列与 Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、进行基因功能注释。对注释成功的 Unigene 预件预测未注释上的 Unigene 的 ORF，得其编码区的量检测结果

图 2-4 GO 的分类图Fig. 2-4 The diagram of gene function classification (GO)KOG 分类结果，转录组所组装的 22718 条 Unigenes 分别分布于 26 个分子家族中，一般功能预测所占比例最高，19.6%，其次是信号转导（19.2%），翻译后修饰、蛋白质折叠、分子伴侣（11.1%）、细胞骨架（6.5%）、转录（5.4%）、翻译（5.3%）等所占比例也较高。2.3.4 钙代谢基因库构建从注释的转录组数据中筛选了钙调节基因 1313 条，其中与生物矿化相关的钙代谢基因 415 条（附录 3.1），主要包括钙结合蛋白（calcium binding protein,CABP, CAB）、45 kDa 钙结合蛋白（45 kDa calcium-binding protein）、含 EF-hand 钙结合结构域蛋白（ EF-hand calcium-binding domain-containing protein,EFCAB）、N 末端含 EF-hand 钙结合结构域蛋白（N-terminal EF-hand calcium-binding protein, NECAB ） 、 钙 结 合 蛋 白 32 （ calbindin-32 ） 、 钙 调 蛋 白

蛋白酶水解蛋白质样品→裂解的肽段用 iTRAQ 试剂进行差异标记→一级质谱（质谱与液体色谱联用）→一级质谱的前体离子经过碰撞诱导解离（串联质谱的方法），通过二级质谱对产物离子进行分析→蛋白质定量信息处理。如图 4-1 所示。
【参考文献】

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本文编号：2864736