卡拉胶作为一种安全的食品添加剂,具有凝胶、增稠和保水特性,是食品加工行业的重要原料。热带海域生长繁殖的大型藻类——长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)、异枝卡帕藻(Kappaphycus striatum)和细齿麒麟菜(Eucheuma denticulatum)是重要的产卡拉胶海藻,具有极高应用与经济开发价值。本研究以上述海藻为对象,1)探讨了长心卡帕藻原生质体分离方法,研究纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶等破壁酶对藻细胞的破壁效果,随后利用融合剂——聚乙二醇(PEG-4000)进行细胞融合实验进而成功地实现了原生质体融合;2)利用不同配比的植物生长调剂(植物生长素、细胞分裂素等)、光强梯度以及不同PES培养基类型(固体和液体),通过长心卡帕藻组织培养,研究并优化了该藻新芽形成和愈伤组织诱导发生的条件;显微跟踪观察了该藻愈伤组织形态建成过程,同时,探究了愈伤组织形态建成和新芽形成过程中其光合与呼吸发生的变化;3)以26°C为对照温度,研究了在系列梯度低温(23°C、20°C、17°C和14°C)和高温(29°C、32°C和35°C)下,长心卡帕藻、异枝卡帕藻和细齿麒麟菜(红色和绿色藻株)的各种抗氧化物酶(SOD、GPX、APX、CAT、POD等)酶活性和抗氧化相关物质(H2O2、GSH、GSSG、MDA等)含量变化,并探讨了其抗氧化系统的响应机制;分析测定了温度胁迫下,上述海藻的光合与呼吸速率,光化学效率,PSII天线端、反应中心、电子供体侧、电子受体侧等光系统关键部位的变化;比较研究了两种卡帕藻,红、绿两株细齿麒麟菜对低温(或高温)耐受性的差异。获得的主要结果如下:1、成功获得了长心卡帕藻原生质体,发现蜗牛酶比纤维素酶和果胶酶有更高的细胞破壁效率。但该藻原生质体产率相对较低,原生质体浓度可维持在103-104个/mL,尚难达到细胞融合所需的106-107个/mL细胞浓度。经过初步离心浓缩,原生质体浓度可达到105个/mL,随后用PEG-4000化学法进行细胞融合,可成功观察到原生质体融合现象,但总体融合效率尚有待进一步提高。2、在长心卡帕藻愈伤组织诱导过程中,发现适宜的添加蔗糖、6-BA,使用固体培养基对愈伤组织诱导具有重要作用,其中用“0.5 g/L蔗糖、光强54μmol/m-2·s-1、PES固体培养基(0.8%琼脂)、2 mg/L 6-BA、未加植物生长素”的组合能够更有效地诱导该藻愈伤组织形成;该藻愈伤组织为瘤状的致密细胞团,由不含色素的细长状细胞组成;通过跟踪显微观察该藻愈伤组织形态建成过程,发现其来源于藻髓部小细胞,同时发现形成愈伤组织的藻枝段比形成新芽的藻枝段有较高的光合和呼吸速率,表明产生愈伤组织时的藻枝段细胞会有较高的生理活动与代谢。3.(1)在轻度低温(20°C和23°C)或高温(29°C和32°C)胁迫下,卡帕藻和麒麟菜通过提高抗氧化系统SOD、POD、APX、GPX等几种重要抗氧化物酶的活性、羟自由基去除能力和抗氧化物质GSH的含量以适应温度胁迫,但是在重度低温(14°C)或高温(35°C)下,上述抗氧化酶活性下降、抗氧化物质含量降低,藻体抗氧化系统受到严重损伤,藻机体不能抵御上述胁迫。(2)长心卡帕藻光系统能耐受20°C和23°C低温,异枝卡帕藻仅能耐受23°C低温,但温度在20°C以下时两者皆不能忍受,表明长心卡帕藻比异枝卡帕藻有较强的低温耐受性。相比而言,在适度低温20°C和23°C时,绿色细齿麒麟菜光系统效率有所降低,而红色细齿麒麟菜却未受影响,推测细齿麒麟菜的红色藻株比绿色藻株有更强的低温耐受性。(3)上述藻的PSII天线端、反应中心和电子受体侧对低温敏感性不同:长心卡帕藻PSII天线端比反应中心和电子受体侧对低温敏感,异枝卡帕藻PSII天线端和反应中心比电子受体侧对低温敏感;红色细齿麒麟菜PSII天线端比反应中心和电子受体侧对低温敏感,绿色细齿麒麟菜PSII反应中心和电子受体侧比天线端对低温敏感。(4)最新发现低温胁迫下长心卡帕藻光系统一种可能的受伤机理:低温胁迫通过降低Rubisco LSU的表达量影响光系统暗反应的卡尔文循环(Calvin cycle),使得还原力(如NADPH)增多,光合电子传递链中存在过多剩余电子,从而引起ROS增多。ROS反过来进一步影响基因psbA的翻译,导致D1蛋白前体合成受阻,D1蛋白表达量减少,直接造成PSII修复过程无法完成。正常情况下,PSII损伤和PSII修复过程处于动态平衡,而PSII修复过程无法进行,使得PSII的损伤加重,导致了光系统损伤。(5)虽然长心卡帕藻和异枝卡帕藻光系统都能耐受29°C和32°C高温,但长心卡帕藻在35°C下光系统遭到严重破坏,而异枝卡帕藻光系统却未出现严重损伤,推测异枝卡帕藻比长心卡帕藻有较强的高温耐受性。另外,高温29°C和32°C使得红色和绿色两株细齿麒麟菜光合效率都有所增加,说明适度高温可提高藻光合效率;但35°C高温会导致红色细齿麒麟菜光合系统受损伤,相比而言,绿色细齿麒麟菜能忍受35°C高温,表明绿色细齿麒麟菜比红色细齿麒麟菜有较强的高温忍耐性。(6)长心卡帕藻PSII天线端、反应中心和电子受体侧能承受29°C和32°C的高温,但在35°C高温时上述光合部位受到严重损伤,而异枝卡帕藻的PSII天线端的光吸收效率、反应中心效率和电子受体接受电子效率在所有梯度高温下都未有显著性下降,再次证明异枝卡帕藻比长心卡帕藻有较强的高温耐受性;在35°C高温下,红色细齿麒麟菜反应中心效率未受显著影响,但天线端光吸收效率和电子受体接受电子效率降低,也说明不同光系统部位对高温忍耐性不同。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.3
【部分图文】：
图 2-1 原生质体分离所用的长心卡帕藻（棕色）Figure 2-1 Kappaphycus alvarezii (brown) for protoplast isolation试剂和仪器与溶液液：氢钠（NaH2PO4）贮液（A 液）：取 2.760g 磷酸二氢钠于 100馏水使其溶解，然后转入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧水全部转入容量瓶中，摇匀后加蒸馏水定容至 100 mL。二钠（Na2HPO4）贮液（B 液）：取 14.200g 磷酸氢二钠于 1
体培养基洗涤 l-2次，观察实验结果（加入 PEG-4000融合液后，原生质体只发生粘连，在洗涤过程中才发生细胞膜融合），注意区分细胞融合与细胞重叠。计算融合率，融合率=融合细胞数/总细胞数。图2-2为研究路线图。图 2-2 长心卡帕原生质体获得及融合路线图Figure 2-2 Implementation plan of Kappaphycus alvarezii protoplast harvest and fusion2.3 实验结果与讨论2.3.1 原生质体观察与鉴定经过市售商业酶或篮子鱼肝胰脏研磨液酶解，都获得了原生质体，如下图所示（图 2-3）。
图 2-3 长心卡帕藻原生质体Figure 2-3 Kappaphycus alvarezii proto藻组织细胞，可以看到较小深色皮又分为髓部大细胞和髓部小细胞（细胞，认为此原生质体来自于髓部
【参考文献】
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本文编号：
2865635
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