中华绒螯蟹Rab7和14-3-3Z蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究

发布时间：2020-11-03 02:31

　　 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)又称河蟹、毛蟹,是我国重要的水产经济动物,市场需求量极大,但是随着其养殖规模不断扩大,集约化程度不断提高,病毒、细菌、寄生虫等病原体大量繁殖,各种病害频发,严重影响河蟹养殖业的健康发展,使养殖户遭受了巨大的经济损失。中华绒螯蟹“颤抖病”是河蟹养殖中最常见且最严重的疾病,引起该病的是一种新型水产病原微生物中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)。本课题组前期研究证实,螺原体主要通过河蟹的鳃或体表进入体内,并首先侵染其靶细胞—血淋巴细胞,在其细胞内大量繁殖后随着血淋巴液循环而侵染包括肝脏、心脏、消化道、鳃、肌肉、神经等器官的结缔组织中,引起河蟹感染前期的无力、不食,后期由于神经组织中的病原大量侵染而引起河蟹附肢的颤抖,最终导致死亡。因此,探究螺原体侵染时,河蟹血淋巴细胞产生免疫反应的机制,对降低该病菌对河蟹养殖业的危害有着深远的意义。本课题组前期利用iTraq技术筛选了螺原体侵染前后河蟹血淋巴细胞中差异表达的蛋白,并挑选了两种重要的蛋白Rab7(EsRab7)和14-3-3Ζ(Es14-3-3Ζ)做了初步研究,证实它们参与到了螺原体侵染的过程中,本文在此基础上对这两个蛋白的功能做了进一步的研究,包括筛选靶向互作microRNA,在细胞水平上开展RNA干扰和重组蛋白过表达实验验证其免疫功能,具体研究内容从以下三个方面来开展:1.中华绒螯蟹EsRab7和Es14-3-3Ζ相互作用microRNA的鉴定及功能研究螺原体刺激后,河蟹血淋巴细胞中EsRab7的转录水平在6 h开始显著上调并持续至24 h,Es14-3-3Ζ的蛋白表达量在12 h和24 h均显著上调,证实这两种蛋白参与到了螺原体侵染的过程中。进而双荧光素酶报告基因检测筛选得到两种能够分别靶向作用于EsRab7和Es14-3-3Ζ基因的microRNA:miR-131-3p和miR-2309,证实了它们能够分别沉默EsRab7和Es14-3-3Ζ基因,并检测了它们在河蟹各组织中的分布情况,结果显示,两者在肝胰腺中的表达均最高,其次为神经,并且在血淋巴中也有表达。在个体上用螺原体刺激河蟹后,检测了10 d内各时间点miR-131-3p和miR-2309在血淋巴和神经中的表达谱,结果显示在2-6 d,两者在血淋巴中均呈现显著下调的趋势,而在神经中,两者均在4 d开始显著下调并一直持续到10 d。以上结果说明河蟹被螺原体侵染后,miR-131-3p与EsRab7基因、miR-2309与Es14-3-3Ζ基因之间的调控关系在其免疫过程中发挥着重要的作用。2.中华绒螯蟹Rab7蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究利用化学合成的miR-131-3p成功干扰了河蟹血淋巴细胞中EsRab7基因,并在螺原体刺激24 h后,检测了细胞形态和活力、抗菌肽表达、螺原体拷贝数等指标,结果显示,EsRab7沉默组的细胞死亡最多,细胞活力和抗菌肽EsALF1、EsALF2和EsALF3的表达显著低于对照组和inhibitor组,螺原体拷贝数显著高于对照组和inhibitor组。在果蝇S2细胞中过表达了EsRab7-GFP蛋白并在螺原体刺激48 h后,检测了细胞形态和活力、螺原体拷贝数等指标,结果显示,过表达组的细胞存活最多,细胞活力显著高于对照组,螺原体拷贝数显著低于对照组。以上结果说明miR-131-3p与EsRab7基因相互作用在螺原体的侵染过程中发挥着重要的作用。3.中华绒螯蟹14-3-3Ζ蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究利用化学合成的miR-2309成功干扰了河蟹血淋巴细胞中Es14-3-3Ζ基因,并在螺原体刺激24 h后,检测了细胞形态和活力、免疫相关基因表达、螺原体拷贝数等指标,结果显示,Es14-3-3Ζ沉默组的细胞大批死亡,细胞活力、抗菌肽以及免疫相关基因Relish和ERK表达显著低于对照组和inhibitor组,EsRab7转录水平也随着Es14-3-3Ζ的变化而正相关改变,同时实验组螺原体拷贝数显著高于对照组和inhibitor组。利用过表达技术在果蝇S2细胞中过表达了Es14-3-3Ζ-GFP蛋白并加入螺原体刺激48 h后,检测了细胞形态和活力、螺原体拷贝数等指标,结果显示,过表达组的细胞存活最多,细胞活力显著高于对照组,螺原体拷贝数显著低于对照组。以上结果说明miR-2309与Es14-3-3Ζ基因相互作用在螺原体的侵染过程中执行着重要的功能。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S945
【部分图文】：

R CGTGCGGCCGCTGGTCAACCCACCTAACCCAF CGACTCGAGACGAGACAACCTGACGCTTTR CGTGCGGCCGCAGGCGGCCTGGAGTAGTAGics sense UUCCUUUCCCUUCCCUUCCUUs sense UGUGAGGGUGGUGGACGGCAGGGics sense GCAUACUGUCACGCUCCGAACA TTCCTTCCCTTCCCTTTCCTTTGTGAGGGTGGTGGACGGCAGGGCTTGCTTCGGCAGAACATATACTAACTGGTGTCGTGGAG巴中 EsRab7 mRNA 和 Es14-3-3Ζ 蛋白在 S. eriocheiris 刺EsRab7 和 Es14-3-3Ζ 在河蟹血淋巴免疫当中的作用，应用 术检测在 S. eriocheiris 刺激血淋巴细胞后，细胞中 EsRab的表达变化。结果显示，EsRab7 基因从 6 h 开始持续上调 GAPDH 作为内参（图 2.1）。Es14-3-3Ζ 蛋白在 12 h 开始 β-actin 作为内参蛋白（图 2.2）。

estern blot 检测在 S. eriocheiris 刺激后河蟹血细胞内 Es14-3-3Ζ 蛋变化。β-actin 作为内参蛋白。.2 Western blot was carried out to detect the expression levels of the Es in hemocytes of E. sinensis after S. eriocheiris infected. β-actin as the protein.信息学预测 microRNA 与靶基因 3′UTR 的潜在作用位点筛选能够与 EsRab7 和 Es14-3-3Ζ 相互作用的 microRNA，an(www. targetscan.org/ mamm 31/)，Miranda (www. microrna. org/ mrm. do)和 PITA (www. pita. ps/)软件在线预测了 EsRab7 3′UTR 与 m，Es14-3-3Ζ 3′UTR 与 miR-2309（图 2.4）的作用位点。

图 2.2 Western blot 检测在 S. eriocheiris 刺激后河蟹血细胞内 Es14-3-3Ζ 蛋白表达变化。β-actin 作为内参蛋白。Fig. 2.2 Western blot was carried out to detect the expression levels of the Es14-3-3Ζprotein in hemocytes of E. sinensis after S. eriocheiris infected. β-actin as the referencprotein..3.3 生物信息学预测 microRNA 与靶基因 3′UTR 的潜在作用位点为了筛选能够与 EsRab7 和 Es14-3-3Ζ 相互作用的 microRNA，我们采argetScan(www. targetscan.org/ mamm 31/)，Miranda (www. microrna. org/ microrna/irna Form. do)和 PITA (www. pita. ps/)软件在线预测了 EsRab7 3′UTR 与 miR-131图 2.3），Es14-3-3Ζ 3′UTR 与 miR-2309（图 2.4）的作用位点。
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本文编号：2867964