中华鳖生长相关分子标记的筛选

发布时间：2020-11-03 01:56

　　 中华鳖(Trionyx sinensis),分类学上隶属爬行纲(Reptilia)、龟鳖(Testudinata)。在我国主要分布于长江流域和华南地区,而西藏、青海和新疆较少;国外主要分布于朝鲜、日本和越南。由于中华鳖具有很大的营养价值、观赏价值和药用价值,使得近些年来中华鳖的养殖业发展非常迅速,其养殖方式多样,主要包括鱼鳖混养、池塘单养和工厂化温室养殖等,2015年年产量突破了34万吨。但是在市场利益驱动下,许多养殖场育种操作不规范,特别是近亲繁殖,导致中华鳖种苗质量良莠不齐,种质出现退化,生长速度减慢,这些状况阻碍了中华鳖产业的可持续发展,因此我们开展了中华鳖良种选育工作,希望能够利用分子标记选育出快长的中华鳖良种品系,以满足人类的消费需求,促进产业的健康发展,也希望为中华鳖的种质保护和良种选育提供一些基础资料和参考数据,从而促进龟鳖类种质鉴定与保护、良种选育的繁荣发展。本实验主要是根据的中华鳖基因组和转录组数据,设计SSR引物,大规模开发分子标记,并对中华鳖的三个群体共72个个体进行了遗传多样性分析。然后利用SSR分子标记技术和分子生物学技术对绿卡(LK)鳖群体的120个体进行生长性状的相关分析,筛选出其生长相关的SSR分子标记。此外,本实验还将功能基因用于育种研究,以胰岛素样生长因子I(Insulin-like growth factor 1,IGF1)作为候选基因,进行基因克隆和序列多态性分析,并利用SNP进行关联性分析,拟从中找到中华鳖生长相关SNPs分子标记,将其应用于鳖的生产养殖上,选育出生长速度快、饲料利用率高的优质中华鳖养殖新品种,并进行示范推广。1.中华鳖微卫星标记的开发及三个群体遗传多样性研究利用中华鳖转录组数据,筛选获得20对具有多态性的微卫星引物。基于此,对中华鳖的三个群体(黄沙群体、洞庭群体和日本群体)共72个个体进行遗传多样性分析。20个微卫星位点在三个群体中显示出很高的多态性,等位基因数为3-26,观测杂合度和期望杂合度分别为0.208-0.958和0.302-0.963,多态信息含量为0.283-0.953。基于上述分析结果,利用MEGA5.0对中华鳖种群构建遗传进化树,可知,三个群体中,黄沙群体和洞庭群体先聚合然后再和日本群体聚合,说明黄沙群体与洞庭群体的亲缘关系较近,而它们与日本群体亲缘关系相对较远,这与它们的地理分布是一致的。本研究开发的20个微卫星标记可作为中华鳖遗传多样性、种群遗传结构、分子标记辅助育种等研究的理想分子标记。2.中华鳖生长相关微卫星标记筛选及应用分析利用筛选到的25个微卫星标记,以中华鳖(绿卡群体)极大、极小两个群体共120个个体为实验材料,分析这些微卫星标记与体重、背甲长、背甲宽、体高、腹甲长及腹甲宽之间的相关性。结果表明:有3个位点与生长性状的相关性达到显著(P0.05)或极显著水平(P0.01),其中位点LTF1与体重、背甲长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽、体高均极显著相关;位点LTR87与体重、背甲长、和腹甲宽显著相关;位点LT8与体重、体高、腹甲长、腹甲宽显著相关。将同一性状不同基因型之间进行多重比较,结果显示位点LTF1中的BE型,位点LTR87中的BB型,以及位点LT8中的CF型、BC型、AC型、CC型具有明显的生长优势,可作为辅助育种的参考标记。3.中华鳖IGF1基因克隆、序列多态性分析及生长相关SNP位点的筛选通过克隆获得了中华鳖的IGF1基因的c DNA序列,序列长为710bp,其中开放阅读框(ORF)为460bp,编码153个氨基酸。并将中华鳖的IGF1的c DNA序列与NCBI数据库中其他物种的c DNA序列进行blastn对比分析,结果显示,IGF1序列在进化上较为保守,中华鳖与其他物种的相似性较高,为85%-98%。利用MEGA5.0对中华鳖IGF1的氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示,中华鳖IGF1基因的氨基酸序列与绿海龟(Chelonia mydas)中相应氨基酸序列的亲缘关系最近,与同属于龟鳖目的西部锦龟(Chrysemys Picta bellii)汇为一支,而与原鸡(Gallus gallus)、扬子鳄(Alligator sinensis)、小鼠(Mus musculus)及人类(Homo sapiens)中相应的氨基酸序列的亲缘关系较远。从中华鳖的极大和极小两个群体的IGF1基因中共筛选到5个有效的SNP位点S1、S2、S3、S4和S5,均位于IGF1的ORF区。SNP位点的基因型与中华鳖两个群体生长性状之间的关联性分析结果显示:S1位点的GG基因型和S3位点的TT基因型对应个体的各个生长性状都显著高于同一位点其他基因型个体。5个SNP位点共组成9种双倍型(D1-D9),其中D9与D5双倍型与中华鳖生长性状发挥正面效应,而D1双倍型与中华鳖的生长性状有负面影响;D9与D5为极大群体中的优势双倍型,D1为极小群体的优势双倍型。以上结果表明中华鳖IGF1基因中单核苷酸多态性位点S1处GG基因型、S3处TT基因型及双倍型D9和D5与中华鳖的快长密切相关,可以作为中华鳖分子标记辅助育种的候选标记。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

利用中华鳖转录组数据，设计开发了 100 对微卫星引物，通过筛选，获得 20对具有多态性的微卫星引物。20 对微卫星引物在 3 个群体 72 个个体中都能扩增出多态性丰富、稳定性强的清晰条带。遗传参数见表 2。黄沙群体、洞庭群体和日本群体的等位基因数分别为 3-22,3-26 和 3-20，黄沙种群的观测杂合度为0.208-0.952，期望杂合度为 0.302- 0.957；洞庭种群的观测杂合度为 0.208-0.958，期望杂合度为 0.395-0.975；日本种群的观测杂合度为 0.208-0.952，期望杂合度为 0.355-0.973；根据 0.25<PIC<0.50 属于中度多态性，PIC>0.5 属于高度多态性可知，在 3 个种群中的多态信息含量分别为 0.283-0.953, 0.283-0.934 和0.363-0.950。其中黄沙群体和洞庭群体中多态信息含量有 3 个处于中度多态水平，其他的都处于高度多态水平；日本群体中有 4 个处于中度多态水平，其他的都处于高度多态水平。哈迪温伯格平衡定律的偏离在表 2 中用“*”表示。基于微卫星分析结果，利用 MEGA5.0 对中华鳖种群构建遗传进化树，见图2-1。从图中可知，黄沙群体和洞庭群体先聚合然后再和日本群体聚合，说明黄沙群体与洞庭群体的亲缘关系较近，而他们与日本群体亲缘关系相对较远，这与它们的地理分布是一致的，而且这一研究结果与刘阳等人的研究结果一致[87]。

图 4-2 中华鳖 IGF1 和其它脊椎动物的分子进化树Fig 4-2: The IGF1 phylogenetic tree of Trionyx sinensis and other reptilia.2 IGF1 结构分析以 NCBI 登录的鳖的 cDNA 为模板，所设计的上下游引物扩增出一0bp 的条带，利用 Protparam 软件在线分析中华鳖 IGF1 氨基酸序列，结果显华鳖 IGF1 的分子式为 C755H1205N223O217S15分子量为 17.3591KDa，共包含 原子。中华鳖 IGF1 多肽链的氨基酸组成和比例见图 4-3，其中氨基酸（）天冬氨酸和谷氨酸（Asp+Glu）的总数为 12，氨基酸（正电荷）精氨酸酸（Arg+Lys）总数为 22，理论等电位点（PI）为 9.27.预测该蛋白不稳定，I不稳定系数（instability index）为 41.20。IGF1 的脂溶系数（Aliphatic ind 72.03，总平均亲水性系数（Grand average of hydropathicity GRAVY）为-0.

图 4-3 中华鳖 IGF1 基因的氨基酸组成ig4-3 The amino acids composition of Trionyx sinensis IGF 软件对中华鳖的 IGF1 的亲\疏水性进行分析，结系数最低，为-2.289，表明该氨基酸位点亲水性最最高，为 2.511，表明该氨基酸位点疏水性最强
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本文编号：2867913