基于纳米粒子的时间分辨荧光免疫法检测水产养殖病原菌

发布时间：2020-11-03 18:40

　　 我国水产养殖业发展迅速,但细菌疾病的爆发,给水产养殖业带来了巨大的经济损失,而传统的酶联免疫分析法、荧光抗体法等免疫检测方法均存在灵敏度低、背景荧光高等缺陷。时间分辨荧光免疫法可有效降低背景荧光,是一种灵敏、高效的检测手段,已在致病菌、有毒化合物等免疫检测上得到了广泛地应用。纳米粒子可与多种生物大分子结合包括抗体,且不影响其生物活性,本研究建立了一种基于纳米粒子的TRFIA检测水产养殖致病菌,研究内容如下:(1)建立了直接纳米粒子TRFIA法检测嗜水气单胞菌B15,将细菌包被于微孔板,抗体标记后的荧光纳米粒子作为检测抗体进行检验。采用正交试验对细菌包被时间、细菌包被温度、纳米粒子-抗体浓度进行了优化,得出嗜水气单胞菌的最低检测限为1.0×10~5cfu/mL。(2)为提高检测灵敏度,将嗜水气单胞菌B15的抗体直接包被于微孔板,建立了双抗夹心纳米粒子TRFIA法。正交试验法对包被抗体浓度、抗体包被时间、免疫反应时间以及纳米粒子-IgG浓度进行了优化。根据优化结果进行实验,得出最低检测线为1.0×10~3cfu/mL。(3)引入生物素-链霉亲和素系统检测嗜水气单胞菌B15,进一步提高灵敏度。将生物素标记嗜水气单胞菌B15的抗体,使用链霉亲与荧光纳米粒子偶联,建立了生物素亲合素(Biotin-Avidin,BA)-纳米粒子TRFIA法。采用正交试验法优化生物素化抗体浓度、生物素化抗体与BA-荧光纳米粒子结合时间、BA-荧光纳米粒子浓度,最终得出嗜水气单胞菌B15的最低检测线为8×10~2cfu/mL。
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S941.42
【部分图文】：

图 1-1 时间分辨荧光测定的原理.1.2 时间分辨免疫荧光检测技术的新进展.1.2.1 酶放大(Enzyme-amplified) TRFIA酶放大时间分辨免疫分析法，是把酶放大与 TRFIA 相结合的一种超灵敏生物分析法由 Diamandis 等在 Bobrow 等的工作基础上提出的[17]。酶放大 TRFIA 的基本原理如图 1-示，将捕捉蛋白包被于微孔板后依次加入分析物和生物素标记的检测抗体，形成了捕捉体-分析物-检测抗体三元复合物，再向体系中加入链霉亲和素标记的酶如碱性磷酸酶ALP），通过碱性磷酸酶的作用将水杨酸磷酸盐转变为相应的水杨酸衍生物。常用的 AL物为 5-氟水杨酸磷酸脂（5-FSAP），ALP 可将其分解为 5-氟水杨酸（5-FSA），5-氟水杨与镧系元素（Tb3+）在碱性条件下和乙二胺四乙酸（EDTA）形成强荧光络合物直接测定光，通过测量荧光强度可计算出待测物质的含量[18]。由于酶放大 TRFIA 集中了酶放大用、生物素-链霉亲和素的高亲和力放大作用，镧系元素 stokes 位移长，荧光寿命长等优，是一种超灵敏、无放射性污染、无需外加增强液的分析方法。Jiang 等人[19]基于镧系元

图 1-2 酶放大镧系荧光体系基本原理中 1 为捕捉抗体，2 为样品分析物，3 为检测抗体，4 为水解和氧化还原表 1-1 不同酶对应的底物及检测限对比 底物 检测限酸酶 不同取代基的水杨酸磷酸盐 0.2amol氧化酶 1,10-邻二苯杂菲-2,9-二羧酸肼 2fmol氧化酶 水杨醛 10-6U苷酶 水杨-β-D-半乳糖苷 90amol荧光共振能量转移的 TRFIA一种非辐射能量转移过程，是指在两个不同的荧光基团中，如nor, D）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor,A）的吸收光间的距离满足一定条件时（一般小于 10nm），能量由处于激发作用以非辐射的方式传递到处于基态的受体[23, 24]。基于 FRE

图 1-3 基于纳米粒子的时间分辨荧光含 Eu 离子的纳米粒子，2 为检测抗体，3 为样品相体系，形成了均相纳米检测体系。包含了记物相比有很高的比活度，如果将这种纳米合物结合到纳米粒子上，将轮流激发能量受的免疫分析，该实验将17β-雌二醇特异重组抗，作为能量供体，雌二醇与近红外的染料 A方法特异性和灵敏度都很好，且易实现自动Kokko 等人[98]还通过实验验证了在聚苯乙烯螯合物相比，在对抗混合物干扰方面是否有性反应实验中，金属离子的存在对荧光能量的耐受性更好，金属离子和不同的pH对标记溶性Eu螯合物和包含Eu螯合物的聚苯乙烯纳米颗粒的方法其检测限是普通可溶性Eu
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本文编号：2868954