异育银鲫粘孢子虫PCR检测方法的建立与初步应用

发布时间：2020-11-04 00:01

　　 异育银鲫是我国重要的鲫鱼养殖品种,随着养殖规模的不断扩大,各类病害接踵而至,病害问题已成为制约异育银鲫产业健康发展的瓶颈因素,尤其是粘孢子虫病,严重威胁着异育银鲫的苗种培育和成鱼养殖。其中,武汉单极虫、洪湖碘泡虫、吴李碘泡虫及丑陋圆形碘泡虫对异育银鲫的危害最为严重,不仅影响宿主的生长发育,使商品鱼失去应有的经济价值,严重时甚至引起感染鱼的大量死亡。为有效控制粘孢子虫病害,亟需建立异育银鲫重要寄生粘孢子虫的快速、准确、实用的检测方法。因此,本研究以这4种粘孢子虫为研究对象,建立单轮PCR与多重PCR检测方法,以期为粘孢子虫病的快速诊断与防治提供技术支持。1.4种粘孢子虫单轮PCR检测方法的建立:分别以武汉单极虫的28S rDNA、洪湖碘泡虫与吴李碘泡虫的ITS-5.8S rDNA、丑陋圆形碘泡虫的18S r DNA基因为分子靶标,各筛选一对特异性引物,特异性产物大小依次为245bp、447bp、590bp、894bp。试验证明4对引物的特异性与通用性良好,无非特异性扩增干扰,对非目的粘孢子虫无交叉反应。灵敏性试验结果显示,四种单轮PCR方法的检测灵敏性均达到了pg级水平。2.4种粘孢子虫多重PCR检测方法的建立:在上述建立的单轮PCR基础上,将4对引物置于同一个PCR体系,通过反应体系与条件的优化,成功在同一个反应体系中扩增出4条目的条带,且能明显区分,无非特异性扩增干扰。灵敏性试验显示,建立的多重PCR方法对四种粘孢子虫的检测灵敏性均达到了ng级水平。3.两种PCR检测方法的初步应用:将两种方法初步应用于104份异育银鲫混合组织DNA样品检测,并与显微镜检测相比较,结果显示,两种PCR方法的阳性检出率均高于显微镜检测,而单轮PCR方法的阳性检出率高于多重PCR方法。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S943
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 异育银鲫粘孢子虫病
        1.1 洪湖碘泡虫病
        1.2 武汉单极虫病
        1.3 吴李碘泡虫病
        1.4 丑陋圆形碘泡虫病
    2 粘孢子虫检测技术
        2.1 形态学检测
        2.2 免疫学检测
        2.3 分子生物学检测
    3 分子检测靶基因
    4 本研究的目的及意义
第二章 四种粘孢子虫单轮PCR检测方法的建立
    1 实验材料
        1.1 样品采集与保存
        1.2 试剂与试剂盒
        1.3 仪器与设备
    2 实验方法
        2.1 粘孢子虫DNA的提取、PCR扩增与克隆测序
        2.2 靶基因选择及引物设计
        2.3 单轮PCR方法的建立
    3 实验结果与分析
        3.1 单轮PCR扩增结果
        3.2 单轮PCR特异性结果
        3.3 单轮PCR灵敏性结果
    4 讨论
    5 小结
第三章 四种粘孢子虫多重PCR检测方法的建立
    1 实验材料
        1.1 样品采集与保存
        1.2 试剂与试剂盒
        1.3 仪器与设备
    2 实验方法
        2.1 DNA提取、PCR扩增与克隆测序
        2.2 多重PCR方法的建立
    3 结果与分析
        3.1 多重PCR扩增与优化结果
            3.1.1 退火温度的优化
            3.1.2 引物浓度优化
2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶平衡浓度优化'>            3.1.3 Mg²⁺、dNTPs、TaqDNA聚合酶平衡浓度优化
            3.1.4 多重PCR优化结果
        3.2 多重PCR特异性结果
        3.3 多重PCR灵敏性结果
    4 讨论
    5 小结
第四章 两种PCR方法的应用与比较
    1 实验材料
        1.1 样品采集
        1.2 试剂与试剂盒
        1.3 仪器与设备
    2 实验方法
        2.1 显微镜检测
        2.2 样品总DNA提取
        2.3 单轮PCR方法应用
        2.4 多重PCR方法应用
    3 检测结果与分析
        3.1 显微镜检测结果
        3.2 单轮PCR检测结果
        3.3 多重PCR检测结果
        3.4 检测结果的比较
    4 讨论
    5 小结
参考文献
附录
致谢

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本文编号：2869294