传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）对凡纳滨对虾生长影响及其致病力分析

发布时间：2020-11-05 02:07

　　 1981年在美国夏威夷地区的细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)中首次发现的传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)是全球养殖对虾疾病中的主要病原之一,IHHNV感染的野生和养殖对虾同时也遍布世界各地,世界动物卫生组织(World Organisation For Animal Health,OIE)将IHHNV收录为甲壳类重要疫病之一(OIE 2015)。IHHNV隶属于细小病毒科,浓核症病毒亚科,短浓核症病毒属。IHHNV感染宿主范围较广,可感染世界各地的野生对虾和养殖对虾,感染的对虾可通过水平或垂直传播的方式传染群体以及下一代仔虾,对细角滨对虾(Litopenaeus stylirostris)死亡率高达90%,同时可引起凡纳滨对虾(L.vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)等生长缓慢,患上慢性矮小残缺综合症(runt deformity syndrome,RDS),造成对虾生长参差不齐。IHHNV是对虾病毒中最小的病毒,病毒粒子大小仅20-22nm,无囊膜二十面体。基因组全长约4.1kb,其中包含3个阅读框,分别为ORF1、ORF2、0RF3,分别编码非结构蛋白1(NS-1)、非结构蛋白(NS-2)和核衣壳蛋白(CP)。目前Genebank中已收录了部分地区的分离株,包括夏威夷分离株(AF21266)、厄瓜多尔分离株(AY362548)、加利福尼亚分离株(AF273215)、中国福建分离株(EF633688)、中国台湾分离株(AY355306、AY355307、AY355307)和泰国分离株(AY362547)等。目前已发现IHHNV有两种基因型,即感染型(type1和type2)和非感染型(type 3A和type3B),其中非感染型属于IHHNV嵌入对虾基因组的情况,该类型可使对虾携带病毒但无致病性和致死性。针对不同的基因型,OIE推荐了5对引物(389F/R、392F/R、77012F/77353R、309F/R和MG831F/R)分别用于检测不同基因型的IHHNV。目前我国对于IHHNV的研究还是不够成熟,关于IHHNV研究的相关报道较少,起步比较晚。而国外起步较早,研究的相对完善。尤其对于目前阶段IHHNV在国内的对虾养殖模式中的流行情况及危害程度仅局限于病毒携带率,而没有IHHNV的感染力和致病性等缺乏相关数据,其次也没有病毒载量与体长关系的相关分析数据。本研究是通过人工感染凡纳滨对虾仔虾和自然状态下感染凡纳滨对虾的两种感染方式,分析其致病力;通过普通PCR和实时荧光定量PCR技术对凡纳滨对虾进行检测,分析其病毒拷贝数,分析病毒载量与体长相关性。从而了解国内IHHNV感染流行情况。本研究的主要内容包括:1.IHHNV人工感染凡纳滨对虾仔虾IHHNV能够感染多种对虾,对幼虾危害最为明显,目前没有更好的防治方法。该病毒可以使凡纳滨仔虾生长缓慢,导致生长规格参差不齐,产量严重下降,损失严重。本文模拟养殖厂的养殖模式进行人工感染凡纳滨对虾仔虾,然后将感染型IHHNV对虾病料梯度稀释后,通过投喂的方式对健康仔虾进行人工感染。观察记录仔虾的死亡和体长变化。结果显示:IHHNV对凡纳滨对虾仔虾的感染率很高,在人工感染24天后开始出现明显死亡,死亡率保持在20.28%-44.25%,40天之后死亡率处于稳定状态,而不同病原之间没有显著性差异;在人工感染后16-44天之间使凡纳滨仔虾体长下调0.74-0.80cm。为IHHNV致病力的研究提供宏观的参考。2.实时荧光定量PCR检测人工感染凡纳滨对虾仔虾实时荧光定量PCR方法因其检测灵敏度高、精确性好、便捷等因素,在对虾病毒检测中应用越来越广泛。本文根据OIE推荐的引物、探针、体系、程序等进行人工感染凡纳滨对虾仔虾的检测。人工感染12d内,凡纳滨对虾仔虾体内病毒拷贝处于上升趋势,攻毒后两天各组之间IHHNV病毒体内拷贝数在103左右,当到12天时IHHNV病毒浓度最高拷贝数达到最大7.91×104 copies/μg DNA,12d-14d拷贝数开始下降,14d之后各组的IHHNV病毒拷贝保持稳定。3.IHHNV、EHP混合感染凡纳滨对虾的PCR检测2013年,河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾育苗期出现死苗、出苗率低的情况,生产上仔虾个体大小差异较大,造成了严重损失。本文采用荧光定量PCR(Real-time PCR)方法对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测。结果显示:传染性皮下及造血组织坏死病毒和虾肝肠胞虫均有检出,IHHNV阳性检出率100%。每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数在103~107之间,且个体较大的样品(1.2~2.0cm)携带病毒拷贝数整体偏高;EHP阳性检出率为49.1%,每微克对虾组织DNA的拷贝数在103~105之间,且集中于个体较小样品(0.7~1.1cm)。对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析显示,IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关关系,虾组织IHHNV平均载量达到8.51×104copies/μg DNA,为较高的感染水平;EHP的载量与对虾生长速率呈负相关性关系,与较大个体阳性检出率较低相对应,虾组织EHP平均载量达到2.19×104copies/μg DNA,为较高的感染水平。由此,该批凡纳滨对虾仔虾患病及损失为IHHNV和EHP的混合感染所致,本文数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S945.49
【部分图文】：

2.3 结果2.3.1 病料病毒含量根据实时荧光定量 PCR 检测结果可知：深圳病原和阿根廷病原中病毒含量最高组（A 组）的病毒含量分别为 6.63×105copies/μg DNA 和 9.17×105copies/μg DNA，最低分别为 2.87×104copies/μg DNA 和 1.94×104copies/μg DNA，各组之间不是呈准确的 10 倍梯度，存在一定的误差。此为阿根廷病原的初始病毒含量要高于深圳病原。如表 2-3，图 2-1。表 2-3 病料 IHHNV 病毒拷贝数（copies/μg DNA）Table 2-3. Number of diseased IHHNV virus （copy copies/μg DNA）A B C D E广东阿根廷6.63E+059.17E+051.39E+051.03E+056.32E+046.32E+043.06E+042.87E+042.87E+041.94E+04

上海海洋大学硕士学位论文图 2-3 阿根廷病原存活率变化Fig 2-3 Argentine change map pathogen survival00.20.40.60.811.20 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52阿根廷A阿根廷B阿根廷C阿根廷D阿根廷E阴性对照空白对照仔虾存活率%/攻毒后养殖天数/天

图 2-7 养殖后期出现生长不齐Fig 2-7 Late growth appeared to grow讨论本章同过人工感染凡纳滨仔虾，分析感染后存活率和体长变化，同时进行阿根廷毒株与中国毒株的差异性分析，从宏观分析了 IHHNV 及不同毒株对凡纳滨仔虾的致病力。传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）是对虾最重要的病源之一，对我国对虾养殖业造成重大经济损失，同时也影响我国的水产养殖业发展。1992 年我国养殖对虾出现由白斑综合征病毒（WSSV）引起的爆发性流行病，给我国对虾养殖业造成毁灭性打击。90 年代中后期，随着凡纳滨对虾的引入，对虾病原也呈现多样性。本实验是在对凡纳滨仔虾、阴性样品亲虾、阳性样品亲虾进行普通 PCR 检测 WSSV、IHHNV、EHP、AHPND 四种病原都符合实验条件的前提下进行实验的，保证了实验凡纳滨仔虾和阴性样品都不带病原，人工感染样品只带 IHHNV。在制备病料过程中都是在冰上操作，而且各组之间严格防止交叉污染。对制备好的病料进行实时荧光定量 PCR 检测，结果显示各浓度之间的梯度不是特别明显，主要是在制备过程中存在误差，其中 D 组和 E 组误差比较大，梯度2.4
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本文编号：2870957