大刺鳅（Mastacembelus armatus）微卫星标记开发及野生群体遗传多样性分析

发布时间：2020-11-08 07:59

　　 大刺鳅(Mastacembelus armatus)隶属合鳃目(Symbranchiformes)、刺鳅科(Mastacembelidae)、刺鳅属(Mastacembelus),是一种广泛分布在我国南部各水系的重要的经济鱼类。近年来,随着经济的迅猛发展,人为过度捕捞和生存条件恶化等原因,促使大刺鳅野生资源下降,因此,保护大刺鳅的野生资源迫在眉睫。物种的遗传多样性(genetic diversity)是其适应环境和保持演化潜力的基础,目前有关大刺鳅遗传多样性的研究较少,因此,本研究以不同水系的大刺鳅为研究对象,利用微卫星标记(microsatellite marker)和EPIC(exon-primed intron-crossing)分子标记,对大刺鳅的遗传多样性和遗传结构(genetic structure)进行研究,为其遗传资源保护和利用奠定基础。本研究的主要内容如下:1.通过PIMA(PCR isolation of microsatellite arrays)法和RAD-seq(restrictionsite associated DNA tags sequencing)法两种方法筛选了66对大刺鳅微卫星引物。每对引物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳进行筛选。PIMA法开发的6对引物中有4对为多态引物,平均等位基因数NA为2.333,平均期望杂合度HE和观测杂合度HO分别为0.272和0.139,平均多态信息含量(PIC)值为0.234,有4个位点经校正后仍偏离哈迪温伯格(Hardy-Weinberg)平衡(P0.05)。RAD-seq开发的60个位点中有30个偏离Hardy-Weinberg平衡,其中有58个位点表现出多态性,平均等位基因数为6.383,平均期望杂合度HE和观测杂合度HO分别为0.602和0.760,平均PIC值为0.537。2.利用10个微卫星分子标记对中国南部10个大刺鳅群体共283个个体进行了遗传多样性分析。结果显示10个微卫星位点在283个大刺鳅个体中共检测出253个等位基因,平均等位基因数NA为3.3~11.1,观测杂合度Ho为0.536~0.913,期望杂合度HE为0.452~0.799,PIC值为0.383~0.699。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示有若干个位点偏离平衡(P0.05)。分子变异分析(AMOVA)表明,遗传变异来源主要在于个体内(75%)。遗传分化系数Fst为0.060~0.393,说明群体间存在高度的遗传分化(Fst0.25)。Structure分析结果显示大刺鳅群体分为5个自由交配群。基于遗传距离构建的UPGMA聚类结果显示10个群体分为5支,西双版纳群体(澜沧江)与其他群体距离最远。主坐标分析(Pco A)的结果与Structure分析的结果相似。瓶颈效应(bottleneck)检测结果表明潮州(韩江)、百色(右江)和五华(梅江)群体可能经历过瓶颈效应。3.基于EPIC核基因标记对10个不同水系的大刺鳅群体进行遗传多样性分析。结果显示共检测到76个简约信息位点,261个变异位点,185个单变异位点。河池(柳江)、乐昌(北江)和恩平(潭江)这3个群体的核苷酸多样性较高,分别为0.00579、000544和0.00548,西双版纳和百色群体的核苷酸多样性较低,分别是0.00265和0.00243。10个群体共有140个单倍型,其中有12个共享单倍型。西双版纳与其他9个群体之间的遗传分化较大,10个群体平均Fst值为0.2103,说明大刺鳅群体间的遗传变异显著。10个群体平均遗传距离是0.0013,西双版纳群体与其他9个群体的遗传距离最远。单倍型网络图结果显示,遗传距离较近的单倍型聚成一簇,西双版纳群体的单倍型较集中。基于遗传距离构建UPGMA聚类树,结果显示,西双版纳先与其他群体分开,接着白沙(南渡江)单独成一支,河池、百色和乐昌聚为一支,再与恩平聚为一支。中性检验(Neutral test)结果显示增城(东江)、五华、龙岩(汀江)和3个群体近期可能经历过种群扩张。4.利用RAD-seq开发的60对微卫星引物对7种鱼类进行通用性扩增。在黄鳝(Monopterus albus)中有15对引物成功扩增,长吻棘鳅(Mastacembelus aculeatus)有13对引物成功扩增,泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)、横纹南鳅(Schistura fasciolatus)和桂林薄鳅(Leptobotia guilinensis)扩增效率较低。其中Mat01位点在7种鱼类中均能扩增出稳定条带,Mad22、Mad27和Mat09三个位点在5种鱼类中成功扩增。二碱基位点的扩增率明显高于三、四碱基。
【学位单位】：广州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

1989; Pethiyagoda, 1991; Shrestha, 1994)，在我国则主要分布于广东省、广西壮族自治区、云南省、海南省和福建省河流中（成庆泰和郑葆珊，1987）。其肉质结实细嫩、味佳、无肌间刺，深受消费者欢迎，但由于数量稀少，渔民大肆捕捞，加上水质恶化，导致其野生资源日渐枯竭。大刺鳅为底栖淡水鱼类，体呈黑褐色，腹部灰白色，头侧有一黑色纵带，身体有几条纵向曲折线在后侧相连形成网状图案，随着个体增大，网纹逐渐模糊，吻突出，前鳃盖骨后缘具有 2~3 根棘(Talwar&Jhingran, 1991)，因表皮具有黏液腺，大刺鳅表皮光滑而具有粘性（陈忠，2005）。Anand et al.(2012)等发现大刺鳅下颌突出，口腔狭小，咽部宽，牙齿小而锋利，向内倾斜。主要捕食小虾、蚯蚓等底栖小型动物，且幼鱼和成鱼的食性没有明显差异。大刺鳅胃壁厚，粘膜层有明显的纵向褶皱，有利于增加对食物的吸收面积，肌肉层较厚，有利于对食物的初步磨碎。

结果A 法开发大刺鳅微卫星位点扩增结果如图 2-1 所示，将 400~1000 bp 的 DNA 片段回收，步筛选图如 2-2，毛细管电泳结果如图 2-3。通过 PIMA 法共开发 6 对微卫星引物，位点信息如表 2-2。300AC8 和 S289AAT5)为单态信息位点。等位基因数为 1~4 为 2.333，期望杂合度 HE和观测杂合度 HO分别介于 0~0.610.300（平均 0.139)之间。有 4 对引物经校正后仍偏离 Hardy– Microchecker 软件进行无义等位基因(null allele)的检测，结基因存在的现象。多态信息含量介于 0~0.533 之间，平均多态表 2-3）。

期望杂合度 HE和观测杂合度 HO分别介0（平均 0.139)之间。有 4 对引物经校正后仍偏离rochecker 软件进行无义等位基因(null allele)的存在的现象。多态信息含量介于 0~0.533 之间-3）。 2-1 RAPD 引物琼脂糖凝胶电泳图（marker 为 D200sult of PCR products of RAPD primers tested by agarose
【参考文献】

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本文编号：2874502