嗜水气单胞菌铁离子限制下差异外膜蛋白质组学及其免疫保护性评价

发布时间：2020-11-08 08:05

　　 嗜水气单胞菌(Aeromona hydrophila)是一种典型的人-鱼-兽共患病的条件致病菌,可引发鱼类患出血性败血症。每年由于该菌导致的流行性疾病给水产养殖业造成巨大的经济损失,严重阻碍着养殖业的发展。在养殖业中,针对该菌引发的疾病,常见的防治措施是抗生素防治,导致细菌的耐药性日益增强。近年来由于疫苗相关技术的快速发展,以及其高效的抑菌或杀菌效果,使之正成为替换抗生素的重要防治措施之一。但是当前疫苗的种类并不多,制约着疫苗的广泛使用。因此,寻找具有免疫原性的保护蛋白,开发新型疫苗,对防治该菌引发的疾病以及抑制其耐药性的蔓延具有重要的现实意义。以往文献报道,细菌的外膜蛋白组分可作为鱼类疫苗的候选蛋白,但多集中在对体外营养富集培养基中表达量较高的少数几个外膜蛋白的研究上,对自然条件下表达的外膜蛋白免疫保护性质研究较为缺乏。而细菌在入侵宿主时,往往处于局部缺铁的环境中,细菌表达特定外膜蛋白并在与宿主竞争铁离子或者参与细胞内部铁离子平衡中起重要的生物学功能。对这些相关外膜蛋白在缺铁环境中的表达及免疫保护特性的研究,有望成为候选蛋白,为当前新型疫苗的开发提供有效候选抗原。本研究利用定量蛋白质组学和分子生物学方法,模拟自然条件下的缺铁环境,分析嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)在正常和缺铁培养基中外膜蛋白的变化差异。采用TMT标记与质谱联用的方法比较两种状态下的月桂酰肌氨酸钠不溶性蛋白组分,共鉴定到682个蛋白,发现有174个表达差异蛋白,其中91个上调表达和83个下调表达,并分别包含21个和10个外膜蛋白。结合生物信息学分析发现,下调蛋白中多数是核糖体蛋白,其主要功能是参与RNA聚合;而上调蛋白主要是铁载体受体蛋白、铁色素载体受体、血红素受体等外膜蛋白以及一些参与抗生素和次生代谢产物合成的蛋白。为验证外膜蛋白在铁离子限制条件下的变化,本论文运用分子生物学技术对AHA_0972(A0KGW8)、AHA_427(A0KQZ1)、AHA3963(A0KQ46)、AHA_0461(A0KFG8)和AHA_1663(A0KIU8)等五个外膜蛋白的相应基因进行体外PCR扩增,利用pET-32a原核表达载体构建相应的重组质粒,成功克隆并获得了高表达菌株。将上述蛋白高表达并纯化,免疫小鼠获得相应的抗体,经检测其效价均达到1:8000以上。Western Blotting分析发现,在嗜水气单胞菌ATCC 7966及强毒株LP-1中,以上五个外膜蛋白在正常培养基下为低丰度蛋白,而在缺铁条件下表达水平显著增加,与质谱分析的结果一致,提示它们可能在铁离子动态平衡中起着重要作用。最后,为检验铁离子相关外膜蛋白对鱼类是否具有免疫保护性,本论文首先提取嗜水气单胞菌ATCC 7966和LP-1正常和缺铁状态下的外膜蛋白分别免疫斑马鱼,并选用嗜水气单胞菌鱼源强毒株LP-1进行攻毒实验,以BSA+佐剂为对照,结果表明免疫嗜水气单胞菌ATCC 7966正常和缺铁状态下外膜蛋白的斑马鱼生存率分别为60%和63.3%,相对免疫保护率分别为53.8%和57.6%;免疫嗜水气单胞菌LP-1相同处理下的外膜蛋白的生存率分别为63.3%和66.6%,相对免疫保护率分别为57.6%和61.5%;对照组(BSA+佐剂)最终生存率为13.33%,提示缺铁状态下的外膜蛋白组分免疫保护性比正常状态下高。另外,进一步对 A0KGW8、A0KQ46、A0KQZ1、A0KIU8和A0KFG8这五个铁载体受体外膜相关蛋白进行免疫评价。将这些蛋白进行高表达并纯化,对斑马鱼进行免疫,然后利用嗜水气单胞菌LP-1强毒株进行攻毒,其生存率分别为46.7%、63.3%、63.3%、73.3%和66.7%,而对照组(BSA+佐剂)为16.7%;相对免疫保护率分别为36%、56%、56%、68%和60%。上述结果表明,除A0KGW8效果较弱以外,其他四个蛋白都具备良好的免疫保护性,可作为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的候选蛋白,同时提示利用定量蛋白质组学方法寻找潜在免疫保护性抗原是筛选鱼类候选疫苗有效的策略之一。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S941.4
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 国内外水产养殖及病原菌爆发状况
    2 水产养殖病原微生物治疗与防治措施
        2.1 抗生素
            2.1.1 抗生素的滥用
            2.1.2 抗生素的滥用的危害
        2.2 渔药抗生素与耐药性
        2.3 疫苗的相关研究
            2.3.1 疫苗的出现
            2.3.2 疫苗的发展时期
            2.3.3 现代疫苗发展时期
        2.4 鱼类疫苗的种类与研究进展
            2.4.1 传统疫苗
            2.4.2 新型疫苗
        2.5 当前鱼用疫苗研发的困难与瓶颈
    3 嗜水气单胞菌的危害与疫苗防治措施
        3.1 嗜水气单胞菌危害
        3.2 嗜水气单胞疫苗研究
            3.2.1 嗜水气单胞菌传统疫苗研究
            3.2.2 外膜蛋白亚单位疫苗
        3.3 铁载体相关免疫
    4 本论文主要研究内容及其生物学意义
第二章 材料与方法
    1 材料
        1.1 生物材料
            1.1.1 实验用菌种
            1.1.2 实验用鼠
            1.1.3 模式生物斑马鱼
            1.1.4 载体
        1.2 试剂材料与来源
        1.3 实验设备
        1.4 试剂的配置
            1.4.1 月桂酰肌氨酸钠不溶性蛋白提取和质谱分析试剂配制
            1.4.2 分子生物学相关试剂配制
            1.4.3 细菌培养相关试剂配制
            1.4.4 SDS-PAGE电泳缓冲液试剂配制
            1.4.5 抗体效价检测相关试剂配制
            1.4.6 蛋白纯化相关试剂配制
    2 实验方法
        2.1 细菌培养
        2.2 月桂酰肌氨酸钠不溶性蛋白的提取
        2.3 蛋白浓度测定
        2.4 蛋白酶解
        2.5 肽段标记
        2.6 LC-Orbitrap质谱鉴定
        2.7 蛋白胶内酶解
        2.8 LC-LTQ XL质谱检测
        2.9 生物信息学数据分析
        2.10 分子生物学相关实验方法
            2.10.1 PCR
            2.10.2 质粒提取
            2.10.3 核酸产物纯化
            2.10.4 限制性内切酶酶切
            2.10.5 连接转化
            2.10.6 菌液PCR
        2.11 包涵体蛋白纯化实验方法
            2.11.1 包涵体蛋白纯化
            2.11.2 复性
        2.12 Western blotting
        2.13 ELISA测定小鼠血清效价
        2.14 斑马鱼和小鼠的养殖
            2.14.1 斑马鱼
            2.14.2 实验小白鼠
        2.15 小鼠血清获取与斑马鱼免疫
            2.15.1 小鼠血清获取
            2.15.2 斑马鱼半数致死量测定
            2.15.3 斑马鱼蛋白免疫
            2.15.4 斑马鱼攻毒
第三章 嗜水气单胞菌铁离子限制下差异外膜蛋白组学研究
    第一节 正常和缺铁状态下外膜蛋白质组学比较
        1 引言
        2 结果
            2.1 正常和缺铁状态下月桂酰肌氨酸钠不溶性蛋白的提取
            2.2 质谱数据质量分析
            2.3 月桂酰肌氨酸钠不溶组分蛋白质谱检测
            2.4 差异蛋白生物信息学分析
                2.4.1 差异蛋白Domain分析
                2.4.2 差异蛋白GO与KEGG分析
            2.5 基因功能注释分析
            2.6 差异蛋白之间的相互作用分析
        3 小结
    第二节 正常和缺铁状态下OMPs差异蛋白验证
        1 引言
        2 原核表达载体构建
            2.1 引物设计
            2.2 原核表达载体构建
        3 蛋白纯化与抗体制备
        4 LC-LTQ XL质谱鉴定
        5 Western blotting分析
        6 斑马鱼免疫实验
            6.1 半数致死量测定
            6.2 外膜蛋白组分免疫保护性实验
            6.3 铁载体受体相关蛋白免疫保护性实验
        7 讨论
总结与展望
参考文献
硕士研究生期间发表的论文
致谢

【参考文献】

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本文编号：2874509