天然植物精油防治养殖大菱鲆细菌性疾病的作用及机制研究

发布时间：2020-11-09 03:54

　　 大菱鲆(Scophthalmus maximus)俗称“多宝鱼”,自从1992年由英国引入我国后,大菱鲆的养殖规模和产量逐年扩大,目前已成为我国北方海水养殖鱼类产量最大的品种。但随着高密度工厂化养殖的迅速发展,细菌性病害问题日趋严重,严重制约了大菱鲆养殖产业的持续健康发展。目前大菱鲆细菌性病害的控制手段主要依赖于抗生素和消毒剂等化学药物,但由此会带来细菌耐药性、养殖水体污染及海产品中药物残留问题。因此,随着人们对海产品质量安全要求的日益提高,迫切需要寻求一种高效安全、环境友好的抗菌制剂替代抗生素和消毒剂等化学药物,并用于控制大菱鲆及其养殖环境中的致病菌,以实现从源头上解决养殖大菱鲆中药物残留问题。植物精油(Essential oils)亦称作植物挥发油,是从芳香植物中提取的具有挥发性的脂溶性天然化合物,具有多种生物学活性,如抗菌、驱杀寄生虫及免疫调节等。鉴于植物精油具有高效抗菌活性,近年来被视为潜在的抗生素替代品并用于防治水产动物细菌性疾病。本论文首先确定大连地区养殖大菱鲆的关键致病菌,在此基础上,首次尝试将植物精油作为抗生素替代品应用于养殖大菱鲆细菌性疾病的防治,具体研究内容如下:(1)大连地区养殖大菱鲆细菌性病原的分离鉴定及抗生素药敏实验。论文完成了对大连地区养殖大菱鲆主要细菌性疾病的流行性病原调查和研究,实验从大菱鲆养殖场采集患腹水、红体、突眼和红嘴4种典型临床症状的病鱼样本,共分离纯化出33株病原菌,通过透射电镜观察、16S rDNA测序、生理生化检测最终鉴定归为3种常见水产致病菌,分别为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,29株),大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi,1株)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii,3株),通过人工攻毒回感试验证实迟缓爱德华氏菌、大菱鲆弧菌和弗氏柠檬酸杆菌是引起大连地区养殖大菱鲆细菌性疾病的关键病原菌;采用Kriby-Bauer纸片扩散法完成了这3种致病菌(共选7株,E.tarda FS-S、HD-C及TY-X;V.scophthalmi HZ-C1;C.freundii HZ-W、HZ-C2及HZ-F)对30种抗生素的药敏实验,结果显示受测菌株均具有多重耐药现象,且存在株间差异性。(2)植物精油对养殖大菱鲆致病菌的体外抗菌活性及其机制。论文通过纸片扩散法和微量肉汤稀释法研究了柠檬醛、山苍子精油、肉桂醛、百里香酚等16种天然植物精油对迟缓爱德华氏菌、大菱鲆弧菌及弗氏柠檬酸杆菌3种致病菌(共选7株,E.tarda FS-S、HD-C及TY-X;V.scophthalmi HZ-C1;C.freundii HZ-W、HZ-C2及HZ-F)的抗菌活性,结果显示肉桂醛、百里香酚和丁香酚对受测菌株具有较强抗菌活性,最小抑菌浓度均小于或等于1μL/mL;柠檬醛、柠檬草精油和山苍子精油的抗菌活性次之,最小抑菌浓度范围为0.25~4μL/mL,随菌种和菌株不同而变化。此外,实验又通过细菌形态扫描和透射电镜观察、胞内乳酸脱氢酶及核酸释放研究山苍子精油对不同致病菌株的膜损伤作用,以初步阐明其抗菌机制。结果发现山苍子精油可破坏致病菌株的细胞膜,并导致胞内蛋白酶和核酸外泄,致使细菌死亡。(3)植物精油的体内抗菌实验。实验选用山苍子精油进行体内攻毒治疗实验,分别对大菱鲆腹腔注射1×10~7CFU/尾E.tarta FS-S,2×10~7CFU/尾V.scophthalmi HZ-C1和1×10~7CFU/尾C.freundiiHZ-C2,攻毒后经0.2μL/mL山苍子精油药浴后,大菱鲆死亡率分别由60%(6/10)降至20%(2/10),50%(5/10)降至0%(0/10),40%(4/10)降至20%(2/10),这为大菱鲆细菌性疾病的防治提供了另一种有效的抗生素替代品;以斑马鱼为模型,腹腔注射2×10~7CFU/尾E.tartaFS-S和1×10~6 CFU/尾C.freundiiHZ-C2,攻毒后经0.2μL/mL山苍子精油药浴后,斑马鱼死亡率分别由90%(9/10)降至20%(2/10),60%(6/10)降至10%(1/10)。总之,本研究初步阐明了导致大连地区养殖大菱鲆病害的几种主要病原,为养殖大菱鲆病害防治提供了病原学基础。在此基础上,我们首次探索利用天然植物精油作为抗生素替代品来防治几种大菱鲆关键致病菌,并通过体外和体内实验证实了植物精油的抗菌效果,为实现海产品“免抗生素”生态健康养殖提供了新途径。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S943
【部分图文】：

患病及健康大菱鲆肝脏（A,C,E,G）及肠道（B,D,F,H）组织切片图

部分分离菌株16SrDNA的PCR扩增结果

患病大Figure2-8Th菱鲆的典型临heclinicalsig临床症状（箭gnsofturbot(箭头显示吻部(arrowsindic部下颌明显充catelocallesi充血）ons)
【参考文献】

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本文编号：2875843