鱼类水霉病病原生物拮抗菌的筛选及其拮抗机理分析

发布时间：2020-11-09 01:13

　　 水霉病为水产养殖中的常见病,危害较大。对于水霉病的防治尚无有效的化学药物,但利用生物之间的拮抗作用进行疾病防治,在渔业生产中已有应用。本研究拟分离获得水霉病原菌,进行种属鉴定;探讨其生长条件;以强致病性菌株作为指示菌,筛选水霉病原菌拮抗菌,进行种属鉴定;优化拮抗菌培养条件;探索拮抗机理,并对拮抗活性物质进行分离纯化,为鱼类水霉病的生物防治奠定基础。研究结果如下:(1)从感染水霉病的罗非鱼病灶处分离得到一株水霉,经鉴定此水霉属于水霉科,水霉属,拟为水霉属中一新种,命名为Saprolegnia LF04;攻毒实验证明LF04对鲤鱼鱼卵的感染率为90%,对河魲鱼卵的感染率为52%;最适生长温度为25℃,pH为7.0,对无机盐比较敏感,2%的盐度能完全抑制其生长;(2)以水霉病原菌LF04作为病原指示菌分离筛选出2株具有较强拮抗作用的拮抗菌:JL04和JL50;经形态学及分子生物学鉴定,JL04为枯草芽孢杆菌,JL50为短小芽孢杆菌。(3)鱼体攻毒和水霉防治实验证明,两株拮抗菌对鱼体没有毒性,鱼体感染水霉的概率降低了45%(JL04)和38.4%(JL50);传代实验证明,两株拮抗菌的拮抗特性都能稳定的遗传给后代;JL04的拮抗谱较JL50要广,JL50只对特定水霉菌株(LF04、LF01)有拮抗性,JL04菌株更能适应实际生产需要。(4)拮抗菌拮抗机制分析发现JL04菌株发酵液对水霉菌丝的抑制率为70%,无细胞发酵液对水霉菌丝的抑制率为40%,均能抑制水霉孢子萌发,因此分析认为该拮抗菌是分泌拮抗物质至培养液中发挥作用;无细胞发酵液对温度、pH、蛋白酶K敏感,故分析认为拮抗物质性质为蛋白质;发酵液蛋白粗品经过分子筛层析和SDS-PAGE电泳检测,确定具有拮抗活性蛋白分子量大约为2.7*104Da。因此该拮抗菌的拮抗机制为分泌具有拮抗活性的蛋白质至胞外抑制水霉菌菌丝生长及孢子萌发。(5)拮抗菌JL04发酵条件及培养基优化:发酵条件的研究结果表明菌株JL04对温度和pH较为敏感,其生长最适温度为32℃,最适pH在5.0-6.0之间,接种量对菌体生长的影响不显著;通过单因素实验和正交实验,初步得到了在实验室条件下的JL04菌株液体发酵的培养基优化配方:6 g/L胰蛋白胨,6 g/L葡萄糖,3.5 g/L酵母提取物,3.5 g/L硝酸铵,2 g/L硫酸镁,3 g/L氯化钙,1 g/L硫酸锰。优化后的培养基,其生长到稳定期的时间缩短了2h,无细胞发酵液对菌丝的抑制率提高了12.5%。
【学位单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S941.431
【部分图文】：

3.3 水霉 LF04 的理化性质3.3.1 温度对水霉 LF04 生长的影响图2-1表示水霉LF04培养72小时以后的生长情况。可知，水霉LF04最适生长温度为25℃，在温度达到或超过35℃时，水霉LF04无法生长，而其在15℃时虽然生长速度缓慢，但还在生长，说明水霉LF04的生长受温度影响较大，不同温度间有显著性差异：水霉LF04的生长环境更适宜低温，当温度升高时，水霉LF04的生长会受到抑制

图2-1温度对水霉LF04生长的影响Fig2-1 The temperature effect on growth of Saprolegnia LFO4注： a、b、c、d、e字母不同表示组间有显著性差异（p<0.05）,下同 .3.3.2 pH 对水霉 LF04 生长的影响图2-2显示了水霉LF04在不同pH条件下培养72小时后的生长情况。可知，水霉LF04受pH的影响较大，不同pH间有显著性差异。水霉LF04最适生长pH是7，过酸或过碱的环境都会抑制水霉菌丝的生长；当pH为4时，水霉LF04的生长完全被抑制；当pH为7时，水霉在生长72小时后铺满平板。eee

de图2-3显示了水霉LF04在不同盐度条件下培养72小时后的生长情况。可知，水霉LF04对盐度非常敏感，0.5%浓度的NaCl都会对其生长形成抑制。在盐度达到2%以上时，水霉菌丝的生长完全受到抑制。当空白水霉长满平板时，1%的NaCl对水霉得抑制率达到了41%。图2-3 无机盐对水霉LF04生长的影响Fig2-3 The NaCl effect on growth of Saprolegnia LFO4图2-3显示了水霉LF04在不同盐度条件下培养72小时后的生长情况。可知，水霉LF04对盐度非常敏感，0.5%浓度的NaCl都会对其生长形成抑制。在盐度达到2%以上时，水霉菌丝的生长完全受到抑制。当空白水霉长满平板时，1%的NaCl对水霉得抑制率达到了41%。3.4 水霉 LF04 鉴定3.4.1 水霉 LF04 形态特征由图2-4可知，水霉LF04菌丝为透明管状。孢子囊呈纺锤状
【参考文献】

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本文编号：2875648