传染性造血器官坏死病病毒糖蛋白重组莱茵衣藻的构建及免疫特性初步研究

发布时间：2020-11-12 03:56

　　 传染性造血器官坏死病(Infectious hematopoietic necrosis of fish,IHN)是由传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis Virus,IHNV)引起的一种急性的、全身性的鱼类传染病,以鲑、鳟等冷水鱼类为主要感染对象,1985年在我国辽宁省本溪市暴发此病,对水产养殖业造成巨大的经济损失。发病时以鱼体出血,肾脏和脾脏造血组织坏死为典型特征,IHN的感染造成成鱼死亡率为10~25%,幼鱼死亡率可达100%,世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties,OIE)将其列为必须申报的动物疫病,为我国的二类疫病,是口岸鱼类的第一类检疫对象。因此研制免疫效果好,安全性高,成本低廉的新型疫苗成为研究的热点。目前利用植物作为生物反应器,开发转基因植物生产生物药品受到科学家们的广泛关注。莱茵衣藻作为一种新型的植物表达系统,不仅具有可准确表达外源基因,生产环境安全性好等一般优势,同时还具有莱茵衣藻细胞结构简单,培养条件容易,繁殖速度快,可大批量生产,同时还具有成本低廉,光合效率高等自身特点,利用其作为生物反应器研制鱼类口服疫苗具有良好的应用前景。并且藻类又是鱼类的天然饵料,用莱茵衣藻研究IHNV病毒更具有得天独厚的优势。本研究将实验室保存的IHNV病毒在单层FHM细胞上扩增,出现典型的CPE时收集细胞毒,提取细胞毒中FHM细胞和IHNV病毒总RNA,以总RNA为模板进行RT-PCR,获得G蛋白基因,将G蛋白基因克隆到pMD-18T载体上成功构建pMD-18T-IHNV-G重组质粒,质粒经TOP10感受态细胞扩增,提取质粒经双酶切验证后,进行基因测序,测序结果显示与已公开IHNV的HLJ-09株(登录号:JX649101)同源性为99%。将pMD-18T-IHNV-G重组质粒和pChlamy-4载体双酶切后回收,用T4连接酶连接,构成pCh-IHNV-G重组质粒。重组质粒pCh-IHNV-G经大肠杆菌TOP10感受态细胞的扩增后,提取质粒进行PCR验证,再将重组质粒线性化,并应用电穿孔技术将其导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻中,利用博来霉素进行抗性筛选,提取转基因莱茵衣藻DNA进行PCR检测,证明IHNV糖蛋白基因已经随机整合到莱茵衣藻核基因组中,提取转基因莱茵衣藻总蛋白,经过SDS-PAGE电泳分析得到一条大约为58KDa的蛋白条带,与预期结果相符。Western blot分析结果显示,转基因莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合,具有良好的反应原性。将转基因莱茵衣藻、莱茵衣藻、PBS溶液分别饲喂给Balb/c小鼠,连续灌胃7天后进行攻毒,并在饲养的第0、7、14、21、28天称量小鼠体重,攻毒后7天,取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,用流式细胞仪检测T细胞亚群的变化。从体重变化上发现在灌服转基因莱茵衣藻期间小鼠体重与对照组相比下降,但在攻毒后小鼠体重增长明显高于对照组和灌服莱茵衣藻组。流式细胞仪检测结果显示灌胃转基因莱茵衣藻组CD4+、CD8+T淋巴细胞含量都有所增加,表明转基因莱茵衣藻能够刺激小鼠体内T淋巴细胞的增值,从而有助于提高机体的免疫应答的作用。本研究表明,转IHNV糖蛋白基因莱茵衣藻可刺激动物体内T淋巴细胞的增值,有助于提高机体的免疫功能。转基因莱茵衣藻具备研制口服疫苗的前提条件,为进一步开发高效安全的口服鱼类疫苗或具有提高免疫功能的藻类饲料打下坚实的基础。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S941.41
【部分图文】：

将IHNV病毒加入FHM单层细胞中进行病毒扩增，置于16 ℃连续培养，第2天开始细胞出现收缩变圆等明显的细胞病变，最后大部分细胞崩解、脱落。而未接毒的对照组细胞生长状态良好，待病变达到如图2-1时可收集细胞毒。

Fig. 2-1 Virus on FHM monolayer cell lesions.RNA 的提取及 PCR 结果NA 的提取出现明显病变，按照TRIZol试剂说明书操作提取细A如图2-2。

M：DL-2000 Marker；1 和 2 均为 IHNV PCR 产物图 2-3 PCR扩增结果Fig. 2-3 The result of PCR
【参考文献】

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1 王光玉;曲径;徐仲;陈雷;程刚;;传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)的危害、检疫及防治[J];中国动物检疫;2006年10期

本文编号：2880207