黄鳝MEF2基因家族克隆及其表达分析

发布时间：2020-11-14 04:30

　　 肌细胞增强因子2(Myocyte Enhancer Factor 2, MEF2)是MADS-Box转录调节因子超家族成员之一。在脊椎动物中,MEF2家族由A、B、C、D四种亚型组成,广泛存在于平滑肌,骨骼肌和心肌等肌细胞中；是调控肌肉发生发育过程中关键的调节因子之一,可激活多种参与肌肉发生发育、肌肉组织再生等相关基因的表达。本试验以黄鳝为实验材料,克隆出黄鳝MEF2基因家族MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D四个成员的全序列,采用实时荧光定量PCR技术研究了黄鳝MEF2家族四基因胚后不同发育阶段、成鱼不同组织和黄鳝骨骼肌损伤再修复试验中的表达变化规律。主要研究结果如下：采用常规RT-PCR和同源克隆等技术克隆获得黄鳝MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D的ORF区序列,登录号分别为：KM103279、KM103280、KM103281和KM103282。长度分别为1593bp、1419bp、1864bp和2412bp,分别编码482,472,477和535个氨基酸。序列分析发现MEF2基因家族四个成员均具有MADS-box功能域和MEF2功能域。MEF2家族四基因在黄鳝胚后不同发育阶段和成鱼的不同组织中均有不同程度的表达。黄鳝MEF2基因家族在黄鳝5g-180g发育阶段呈现有一定波动但整体上呈现上升的趋势,其中MEF2C最为明显。在不同组织中,MEF2基因家族四个成员在骨骼肌的表达量显著高于其他组织(p0.05),其中MEF2A和MEF2D在骨骼肌中的表达量最高,心脏次之,其他组织表达量很低。MEF2B和MEF2C在骨骼肌中的表达量最高,其他组织表达量几乎无差异,且表达量都很低。本研究通常骨骼肌损伤建模,采用冰冻切片技术观察到骨骼肌损伤再修复的过程,通常实时荧光定量技术发现黄鳝MEF2基因家族在黄鳝骨骼肌损伤再修复过程中表现出先上升后下降最后恢复到损伤前表达水平。
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S917.4;Q78
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 黄鳝的营养价值
    1.2 黄鳝的药用价值
    1.3 黄鳝的研究进展
    1.4 肌细胞增强因子2基因家族（MEF2基因家族）研究进展
        1.4.1 MADS-box转录因子家族
        1.4.2 MEF2家族简介
        1.4.3 MEF2的结构
        1.4.4 MEF2在肌肉发育中的调控作用
        1.4.5 MEF2因子在肌肉组织中的表达研究
        1.4.6 MEF2因子的组织表达研究
        1.4.7 MEF2A研究进展
        1.4.8 MEF2B研究进展
        1.4.9 MEF2C研究进展
        1.4.10 MEF2D研究进展
    1.5 损伤试验建模
        1.5.1 麻醉剂
        1.5.2 损伤药剂
        1.5.3 冰冻切片技术与SDH酶组化染色
    1.6 研究的目的和意义
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 取样器材
        2.1.3 实验取材
        2.1.4 实验仪器与试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 总RNA提取
        2.2.2 RNA检测
        2.2.3 总RNADnase处理
        2.2.4 感受态制备
        2.2.5 cDNA第一链合成
        2.2.6 引物设计
        2.2.7 MEF2A,MEF2B,MEF2C和MEF2D编码区PCR扩增
        2.2.8 PCR扩增片段的回收与纯化
        2.2.9 MEF2基因ORF区产物的连接和转化
        2.2.10 挑克隆（蓝白斑阳性克隆筛选）和测序
        2.2.11 实时荧光定量PCR
        2.2.12 数据处理
        2.2.13 冰冻切片的制备SDH酶组化染色
        2.2.14 冰冻切片制备
        2.2.15 SDH酶组化染色流程
第三章 实验结果与分析
    3.1 MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D克隆结果分析
        3.1.1 肌肉总RNA的电泳结果
        3.1.2 MEF2基因ORF区PCR克隆电泳结果
    3.2 黄鳝MEF2基因序列分析
    3.3 黄鳝MEF2基因家族氨基酸同源性比较与遗传距离分析
    3.4 氨基酸序列比对和构建系统进化树
    3.5 氨基酸含量比例
    3.6 黄鳝MEF2基因家族的时空表达结果分析
    3.7 黄鳝MEF2基因家族胚后不同发育阶段表达情况
    3.8 黄鳝成鱼MEF2基因家族不同组织表达情况
    3.9 损伤实验MEF2基因家族表达情况及SDH酶染色结果
第四章 讨论与分析
    4.1 黄鳝MEF2基因家族基因结构讨论与分析
    4.2 黄鳝MEF2基因家族骨骼肌不同发育阶段表达情况讨论与分析
    4.3 黄鳝MEF2基因家族成鱼不同组织表达情况讨论与分析
    4.4 黄鳝MEF2基因家族损伤试验中表达情况讨论与分析
参考文献
致谢
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本文编号：2883078