团头鲂tlrs及irfs基因的克

发布时间：2020-11-20 03:18

　　 团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国特有的经济淡水鱼类之一,但是随着团头鲂养殖密度的增加以及养殖环境的恶化,导致其抗病能力降低,病害频发,尤其是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的细菌性败血症严重影响了团头鲂养殖业的发展,造成了巨大的经济损失,为了解决鱼类养殖中病害多发的问题,越来越多的研究学者开始研究鱼类的免疫应答反应及其调控机制。因此,本研究通过对团头鲂Toll样受体(toll like receptors,tlrs)及干扰素调节因子(interferon regulatory factors,irfs)基因表达及其功能等方面进行分析,有利于掌握其在调节团头鲂抗细菌免疫应答中的作用,为鱼类细菌性疾病的预防和治疗提供基础参考资料。本研究主要结果如下:1.鉴定出4个能够特异性识别细菌组分的tlrs基因,分别为团头鲂tlr5a(Matlr5a)、Matlr5b、Matlr9和Matlr21。序列分析表明,4个MaTlrs都具有典型的TLR蛋白结构特征,包括胞外LRR(Leucine-rich repeat)结构区域,胞内TIR(Toll/interleukin-1 receptor)结构区域及跨膜TM(Transmembrane)结构区域,并预测了胞外LRRCT结构域和胞内TIR结构域的蛋白质3D结构,分析发现二者均呈现较为保守的结构特征,并且LRRCT结构域符合α螺旋和β折叠串联结构的特征。系统进化分析显示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21分别属于TLR5亚家族,TLR7亚家族和TLR11亚家族。利用荧光定量PCR方法检测Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在组织中的表达量,结果显示,其在所有检测的组织中均有表达,并且在免疫器官和淋巴样组织中的表达量相对较高。此外研究还发现,嗜水气单胞菌可以有效的诱导Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在感染后团头鲂的肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃中上调表达。2.克隆得到11个团头鲂irfs(Mairfs)基因,利用Clustal W和SMART在线分析蛋白质序列特征,结果显示,这11个蛋白质都属于非跨膜蛋白并且无信号肽序列,除了MaIrf1和MaIrf2,其余MaIrfs都含有两个保守功能域:IRF和IRF3功能域。预测11个MaIrfs蛋白质的氨基端和羧基端3D结构,结果显示,同一家族的Irfs因子蛋白质的氨基端结构几乎一样,显示出极高的保守性。系统进化分析显示11个MaIrfs分别属于IRF1亚家族,IRF3亚家族,IRF4亚家族和IRF5亚家族。利用荧光定量PCR方法检测了11个Mairfs基因在组织中的表达情况,发现其在所有检测的组织均有表达,而且在免疫器官和淋巴样组织中的表达量相对较高。研究还发现,嗜水气单胞菌感染团头鲂后,可以有效的调控这些基因在肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃中的表达变化,参与机体抗嗜水气单胞菌的免疫应答。通过原核表达系统获得团头鲂核因子κB抑制蛋白β(MaIκB-β)可溶性蛋白,以及MaIrf1和MaIrf2不可溶蛋白,并对其进行抗菌性试验,结果显示获得的MaIκB-β可溶性蛋白在体外试验中并没有抗菌作用,但Western-Blot(WB)和Immuno-Fluorescence(IF)试验结果显示在嗜水气单胞菌感染的过程中,干扰素调节因子与炎症因子都参与了抗菌免疫应答。3.通过构建真核表达质粒,在鲤EPC细胞研究了团头鲂4个Matlrs在信号传导过程中功能的相似性及差异性,利用GFP融合蛋白对其进行亚细胞定位,激光共聚焦结果显示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21蛋白质都位于细胞质中,其中MaTlr5a和MaTlr5b与早期内涵体和晚期内涵体位于不同位置,而MaTlr9和MaTlr21与早期内涵体和晚期内涵体都位于同一位置。利用过表达载体研究Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21全长基因对干扰素相关免疫因子的转录调控,结果表明其均能诱导irf3、irf7、isg15、mx1、pkr和viperin的上调,说明团头鲂4个Matlrs的信号传导过程是相似的,但是其上调的时间与上调基因表达量的程度是不同的,对viperin、isg15和irf7上调程度较高,pkr上调程度最小,而且Matlr5b最先调控干扰素通路,可能发挥主要功能,Matlr21最后调控,可能在信号传导过程中发挥辅助作用。因此它们在执行功能中可能有差异,但是都能够参与机体抗病原体的免疫应答。4.利用克隆方法获得6个Mairfs启动子序列,序列分析发现其启动子序列中都有核转录因子κB(NF-κB)位点。利用双荧光素酶报告试验探究了Matlrs对Mairfs启动子的调控关系,而且在人类293T细胞和鲤EPC细胞这两种细胞系中得到的结果相似,说明此信号传递的过程不受物种限制。双荧光素酶报告试验结果显示团头鲂Matlr5a和Matlr9能够促进Mairf7启动子活性,但是不能促进其他基因的启动子活性;Mairf5b能够促进Mairf1和Mairf7启动子的活性,而Matlr21并不能促进任何Mairfs启动子活性,说明Matlrs对Mairfs启动子的调控较为复杂。利用细胞凋亡试验研究过表达Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21后,在细菌感染细胞过程中对细胞凋亡的调控,试验结果显示MaTlr5a,MaTlr9和MaTlr21都能够在一定程度上抑制了细胞凋亡,而MaTlr5b在一定程度上促进了细胞凋亡。综上所述,在团头鲂Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21以及Mairf1、Mairf2、Mairf3、Mairf4a、Mairf4b、Mairf5、Mairf6、Mairf7、Mairf8、Mairf9和Mairf10在抵抗嗜水气单胞菌感染过程中能够调控机体免疫,通过二者的相互作用,能够更好的保护机体免受病原体的入侵,但是Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21在信号传导及行使功能过程中具有一定的差异,这为进一步探究鱼类Tlr及Irf信号通路在抗细菌过程中的调控奠定基础。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

团头鲂 tlrs 及 irfs 基因的克隆、表达及其功能研究据 TLRs 识别的 PAMPs 不同，其细胞定位也不同，且具有特异性。 般原体表成分的 TLRs 都定位在细胞膜上，而识别病原核酸成分的 TLR器膜上（如内体膜）（AgrawalandKandimalla2007），如 TLR3、7、8、化的细胞定位，对 TLRs 与特异性配体结合及细胞内信号转导都起到作用（BartonandKagan2009）。尽管鱼类有 些特殊的 Tlr 存在，但是物中 TLR 级联招募的下游接头分子相似并且信号传导功能 致（图 1家对比较低等脊椎动物和哺乳动物先天和适应性免疫防御机制的研究。

RAM 和 SARM（Akira et al 2006）。所有的 IRFs 氨基端均包含 D，能够识别干扰素及干扰素刺激基因相似的DNA序列（Escalante TLR 介导的下游信号通路主要是两条：MyD88 依赖型和 MyD88-TRIF 依赖途径）信号通路，所有 TLRs 均激活 MyD88 依赖通路3 和 TLR4 还可以激活 MyD88 非依赖通路。比如，TLR4 在 MyD88 非依赖型信号通路中均能发挥作用，TLR4 可以通过诱导 MyD激活 IFN-β 的产生，如果没有完全激活，则可以通过 MyD88 非依在 TLR4 调控炎症细胞因子诱导基因（如 TNF 和 IL-6）活化时，途径来完全激活。而且这两条途径都与下游的两条信号通路的活 MAPK 信号通路。前有大量研究表明， 些 IRF 家族成员也能被 MyD88 依赖和 My活，并对 TLRs 诱导的特定基因的表达起到协同作用，所以，IRFs TRIF 依赖型信号通路中发挥重要作用（图 1-2）。

表Matlr9-qF CACAACCGCATTGACCTGTATlr9Matlr9-qR CGATGTCCCATACCCTTCATMatlr21-qF TCGCAGTGAATGGTGCTCTlr21Matlr21-qR GGACAGTTGCCGCTTAGGTAβ-actin-F ACCCACACCGTGCCCATCTAβ-actinβ-actin-R CGGACAATTTCTCTTTCGGCTGMatlr5a-F ATGGCAACAAGATGCACTTTATCTTlr5aPCRMatlr5a-R TTACACTGCAGTGTCTGCTTGCAMatlr5b-F ATGGGATTTACATTCATTCTGATCCTlr5bMatlr5b-R TTATACTGCTGTGTTTGCATGGACAMatlr9-F ATGTTTGGATACGTGTATTTGATTCTCTlr9Matlr9-R TTAGAAGAAGCTCTCTATGACATTTTTGMatlr21-F ATGGCAGCTTCTGCATGTCGTlr21Matlr21-R TCAGGGCATTAGGTAATACTCTTCC
【参考文献】

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本文编号：2890861