十足目虹彩病毒1（DIV1）的易感宿主调查

发布时间：2020-11-20 13:01

　　 十足目虹彩病毒1感染(Infection with Decapod iridescent virus 1,IDIV1),是一种能够导致甲壳动物高死亡率(可达100%)的新发疫病。该病的病原为十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1),目前包含两个病毒株,即:虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)和红螯螯虾虹彩病毒(Cherax quadricarinatus iridovirus,CQIV)。这两株病毒的基因组相似性为99%。其中,SHIV由本实验室首次完成分离、鉴定、测序分析、命名及检测方法建立等一系列工作。IDIV1首先发生于中国福建,2017年,我国正式启动DIV1的监测计划,涉及13个省(直辖市)。其中,6个省出现了IDIV1疫情。目前还没有控制IDIV1传播的良好措施。本论文旨在调查、评价不同甲壳动物对DIV1感染的敏感性,初步揭示DIV1的易感宿主和生物载体,从而为IDIV1的疫病防控和甲壳动物的健康养殖提供基础。1.脊尾白虾对十足目虹彩病毒1的易感性研究本研究中,通过投喂DIV1(SHIV 20141215)感染的凡纳滨对虾病料和注射病毒粗提液(注射感染)的方式人工感染脊尾白虾。感染后的脊尾白虾表现出明显的临床症状,包括额剑基部出现轻微“白头”、活力减弱、空胃、肝胰腺颜色变浅、空肠和死亡,投喂组、注射组和对照组的累计死亡率分别为(50.0±26.5)%、(76.7±18.3)%和6.7%。TaqMan探针法实时定量PCR结果显示,死亡的和具有典型临床症状的脊尾白虾均为DIV1阳性。组织病理学观察发现,被感染的脊尾白虾的肝胰腺血窦、造血组织和甲壳下上皮存在嗜酸性包涵体和核固缩现象,并且部分嗜酸性包涵体里面或周围有微小的嗜碱性染色。原位地高辛标记的环介导等温扩增(in situ DIG-labeling-loop-mediated DNA amplification,ISDL)检测发现,被感染的脊尾白虾的胃、造血组织、甲壳下上皮组织和肝胰腺血窦中都观察到蓝紫色阳性杂交信号。采用透射电镜对感染的脊尾白虾各组织超薄切片观察发现,在肝胰腺血窦、鳃、步足、肌肉和游泳足的血细胞中存在大量的二十面体病毒粒,直径约150 nm,成熟的病毒粒子主要分布在细胞膜附近的细胞质,位于病毒发生基质的边缘。综合以上分子生物学、组织病理和透射电镜的检测结果,表明脊尾白虾是DIV1的一种易感宿主。2.三疣梭子蟹等多种甲壳动物对十足目虹彩病毒1的易感性调查本研究通过投喂或注射攻毒方式对三疣梭子蟹、中华锦绣龙虾、天津厚蟹和寄居蟹进行人工感染实验,通过投喂吸附DIV1(SHIV 20141215)的小球藻进行卤虫的人工感染实验。其中,三疣梭子蟹能够被DVI1成功感染,而天津厚蟹、寄居蟹和锦绣龙虾中均未检测到SHIV感染。被感染的三疣梭子蟹表现出活力减弱、空胃、空肠和死亡,且上皮、性腺、鳃、心脏、肝胰腺、胃、肌肉和肠等组织经qPCR检测均为DIV1强阳性;组织病理上呈现核固缩及嗜酸性包涵体;对以上各组织的ISDL检测同样都观察到了蓝紫色阳性信号;通过透射电镜观察也发现在以上各组织的细胞内外存在大量的二十面体病毒粒子,大小约136.4±16.1 nm(n=90)。卤虫攻毒实验的结果显示,DIV1在卤虫体内的病毒载量随感染时间增加而降低。攻毒后1天,DIV1在卤虫体内的载量达到10~6 copies/ng-DNA,但在攻毒后7天,DIV1在卤虫体内的检测呈阴性。另外,ISDL的结果表明,在攻毒3天后的卤虫样品检测到蓝紫色阳性信号,仅分布在附肢周围,但在攻毒7天后的卤虫样品中未检测到阳性信号。以上结果表明,三疣梭子蟹是DIV1的一种易感宿主,而天津厚蟹、寄居蟹、卤虫、锦绣龙虾均不是DIV1的易感宿主。3.一例罗氏沼虾自然感染十足目虹彩病毒1的病例研究罗氏沼虾是一种重要的淡水养殖动物。近年来,罗氏沼虾养殖场暴发的一种新疾病,俗称“白头”病,在中国造成了严重的经济损失,但尚未明确“白头”病的病原。在本研究中,我们从江苏省某暴发“白头”病的罗氏沼虾养殖场,采集了罗氏沼虾、日本沼虾、克氏原螯虾、细螯沼虾、凡纳滨对虾和一些枝角类样品,并进行了病原学分析。这些样品的qPCR检测均为DIV1阳性。组织病理学观察发现,罗氏沼虾和日本沼虾的造血组织、肝胰腺和鳃中存在嗜酸性包涵体和核固缩现象;另外,在它们的造血组织、血细胞、肝胰腺和触角腺中也检测到ISDL的蓝紫色阳性杂交信号。此外,在罗氏沼虾造血组织的超薄切片中发现大量DIV1粒子,平均直径约157.9 nm,并在血细胞中观察到病毒装配区和正在出芽的病毒。通过TaqMan PCR定量检测DIV1在罗氏沼虾不同组织中的病毒分布,结果表明DIV1在造血组织中分布量最高,相对丰度为(25.4±16.9)%;肝胰腺和肌肉中的分布量最低,相对丰度分别为(2.4±1.2)%和(2.4±2.2)%。综合以上结果,我们初步判定DIV1是罗氏沼虾“白头”病的病原,日本沼虾和克氏原鳌虾也是DIV1的自然宿主。综上所述,本论文的研究结果表明:(1)罗氏沼虾、日本沼虾、克氏原螯虾、脊尾白虾和三疣梭子蟹是DIV1的易感宿主,而天津厚蟹、寄居蟹、卤虫和锦绣龙虾并非DIV1的宿主;(2)感染DIV1的甲壳动物呈现活力减弱、空肠、空胃等临床症状,被感染的脊尾白虾和罗氏沼虾的临床症状还表现为额剑基部造血组织发白,即“白头”症状;(3)在组织病理上,被感染的肝胰腺、鳃等组织存在嗜酸性包涵体、发生核固缩现象,在嗜酸性包涵体的里面或周围存有嗜碱性微粒。本论文的相关研究结果,将有助于DIV1致病机制和IDIV1疫病防控技术的深入研究,为IDIV1疫病传播控制措施的制定提供技术指导。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S941.41
【部分图文】：

上海海洋大学硕士学位论文照组之间差异极显著（P<0.01）。三参数 Sigmoid 方程的非线性回归，注射和投喂感染 DIV1 的( )=70.77±0.211+ (4.76±2.49) (2.64±0.21)（公式 2-2） ( )=42.52±1.221+ (0.82±0.51) (3.83±0.87)（公式 2-3）数中可知，通过肌肉注射感染 DIV1 导致的累计死亡率是（70.7染导致的累积死亡率是(42.52±1.22)%。注射组达到最高累计死间是（2.64±0.21）dpi，瞬时发病率为（4.76±2.49/天；投喂组在（3到最大累计死亡率的一半，瞬时发病率为（0.82±0.51/天。

15图 2-4 DIV1 阴性和阳性感染脊尾白虾的 HE 染色图。黑色箭头指示核固缩，白色箭头指示嗜酸性包涵体。肝胰腺（a 和 b）；造血组织（c 和 d）；甲壳下上皮（e 和 f），在脱水前已经去除角质层。 a，c 和 e 是 DIV1 阳性脊尾白虾的组织; b，d 和 f 是对照虾的组织。HpT：肝胰管；HpS：肝胰窦；Hm：造血组织；Ep：上皮；Cn：结缔组织；m：有丝分裂期。标尺=50 μmFigure.2-4 Histopathological examination of E. carinicauda tissues infected with DIV1 andcontrols. Black arrows show the karyopyknosis and white arrows show the eosinophilic inclusions.Hepatopancreas （a and b）; hematopoietic tissues （c and d）, and cuticular epithelium （e andf） on which the cuticles were removed before dehydration. The pictures in the left column （a, c,and e）are the tissues of the infected prawn; the pictures in the right column（b, d, and f）are the

上海海洋大学硕士学位论文tissues of the control prawn. HpT: hepatopancreatic tubule; HpS: hepatopancreatic sinus; Hm:haematopoietic tissue; Ep: epithelium; Cn: connective tissue; m: mitotic phase. Bar = 50 μm2.3.4 LAMP 引物设计和反应针对 DNA-directed RNA polymerase II second largest subunit 基因设计 LAMP引物，扩增序列位于SHIV20141215基因组全长序列（GenBank序列号：MF599468）的 69047-69263 位置，其序列与 CQIV CN01 的 77416-77200 的序列完全匹配（图5）。另外，LAMP 引物特异性检测结果显示，这个反应只有对 DIV1 感染的虾的显示阳性，而对 WSSV，AHPND，IHHNV 或 EHP 感染的虾，反应均为阴性。 这表明本研究中的 LAMP 引物特异于 DIV1，可用于 ISDL。
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本文编号：2891454