螺原体隶属于柔膜体纲,是一类无细胞壁、具有螺旋外形和运动能力、基因组精简的细小微生物。中华绒螯蟹螺原体Spiroplasma eriocheiris已经被证实是导致中华绒螯蟹颤抖病的病原,是第一个在水生甲壳动物体内发现的螺原体类微生物,基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,该病原与非凡螺原体Spiroplasma mirum有高达98%的相似度,S.mirum最初从兔虱蜱上分离得到,后被证实能感染脊椎动物刚出生幼体并诱发白内障,还能利用鸡胚增殖并最终导致鸡胚死亡。与S.mirum相似的是,S.eriocheiris也具有感染乳鼠并导致白内障病症的能力(不能感染成年小鼠),感染鸡胚时S.eriocheiris能通过鸡胚卵黄囊传播至体内各组织,随后出现在鸡胚脑部。虽然螺原体感染脊椎动物的组织病理学证据很明显,但其感染机制方面的报道却很少。基于课题组前期建立的S.eriocheiris感染小鼠胚胎成纤维细胞3T6的细胞感染模型,运用表达谱芯片和microRNA芯片技术筛选3T6细胞被S.eriocheiris感染前后mRNA和miRNA的差异表达,并用生物信息学方法及实验手段对芯片结果进行联合分析和功能验证。另一方面,应用酵母双杂交技术来筛选S.eriocheiris黏附蛋白ALP的互作蛋白,探讨其在病原入侵宿主细胞过程中的作用,这些都将为阐述S.eriocheiris对宿主感染的分子机制奠定基础。1.基于表达谱芯片技术研究S.eriocheiri 侵染3T6细胞的机制为深入研究螺原体侵染3T6细胞的分子机制,我们进行了表达谱芯片实验,选取未感染和螺原体感染6 h后的3T6细胞,分两组,每组3个平行,共6个实验样本,按表达谱芯片RNA质控标准,提取了细胞的总RNA,用Agilent小鼠GE 4×44K v2芯片(包含39430个探针)进行基因表达分析,按照表达谱芯片操作流程,对总RNA进行了 cDNA反转录、荧光标记、探针杂交及数据扫描等,采用MeV可视化软件检测差异表达探针确认显著差异表达基因,实验最终筛选出619个差异表达基因(183个上调,436个下调),随后使用DAVID在线数据库对显著差异表达基因进行功能富集分析,并利用STING在线数据库研究差异表达基因在蛋白质相互作用网络中的分布情况,GO和KEGGpathway分析发现差异表达基因集中在神经营养因子信号通路、阿尔茨海默病、胰岛素信号通路、黏着斑、轴突导向等14条信号通路上。2.S.eriocheiris侵染3T6细胞过程中差异microRNA的筛选miRNA芯片实验在杭州联川生物公司完成,选用的是MRA-1002 miRmouse v20芯片,基于Sanger miRBase 20数据库进行数据分析。每个芯片都包含多个控制探头,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B是单基匹配检测探头。RNA样本为表达谱芯片同批的6个细胞总RNA,杂交前6组样品分别添加了 20个碱基的阳性对照序列,PUC2PM-20B和PUC2MM-20B的强度比值大于20的列为差异条带,用单因素方差分析计算P值,用Cluster 3.0和TreeView软件来进行聚类和主成分分析(PCA)。miRNA芯片共检测出1982个3T6细胞miRNA,相较于对照组,被感染组3T6细胞有22个差异显著的miRNA(8个上调,14个下调),依据“种子”序列原则,我们用TargetScan、miRanda和PicTar三种软件来预测差异miRNA的靶基因,综合软件分析结果,共获得靶基因数量3781个。在这22个差异miRNA中,5个miRNA(2个上调,3个下调)信号强度小于500,以上结果说明螺原体侵染3T6细胞状况下,宿主3T6细胞表现出一个独特的miRNA表达模式。3.S.eriocheiris侵染3T6细胞RNA联合分析及功能验证结合上述表达谱芯片和miRNA芯片结果进行联合分析,对比差异表达的miRNA靶基因和mRNA微阵列的差异表达基因,筛选出177个共同基因,并重点关注其中miRNA和mRNA变化负相关的共同基因进行KEGG通路分析,结果表明,相关基因大量集中于黏附和MAPK信号通路,说明这两个通路是螺原体感染宿主细胞的重要途径。为了验证基因芯片的结果,从以上两个通路中选取了 8个mRNA进行实时荧光定量PCR和Western blotting验证实验:黏附(β-Catenin、Parvin、Grb2 和 ERK);MAPK 信号通路(FGFR、Grb2、ERK、MKK3、p38和JNK),看家基因GAPDH作为对照。验证实验得到的变化趋势是β-Catenin(上调)、Parvin(上调)、FGFR(下调),ERK(下调),MKK3(下调)、p38(下调)芯片和RT-PCR结果趋势是一致的,Grb2在微阵列分析中结果是下调,但RT-PCR结果是没有显著变化,各基因免疫印迹结果与RT-PCR结果相吻合。同时也选取了 8 个 miRNA(mir-143-3p,mir-214-5p,mir-322-3p,mir-328-5p,mir-351-5p,mir-466h-5p,mir-503-5p 和 mir-30c-1-3p)进行 qPCR 验证,管家基因U6 miRNA作为对照,其中5个来自MAPK信号通路的miRNA均显示上调,其芯片和qPCR的结果得到了相互佐证。我们推测,当3T6细胞被螺原体感染后MAPK信号通路被抑制,细胞正常代谢遭到破坏,使得病原更易感染细胞。4.S.eriochei i 黏附蛋白ALP在侵染3T6细胞过程中的作用利用免疫胶体金及Western blotting技术来对S.eriocheiris黏附蛋白ALP进行定位,免疫电镜观察结果显示ALP在螺原体的膜表面;将S.eriocheiris全蛋白、膜蛋白及胞质蛋白分别与ALP多抗血清孵育后进行免疫印迹实验,结果显示全蛋白及膜蛋白有印迹条带而胞质蛋白则没有,这与免疫电镜结果相吻合。研究还发现ALP参与了螺原体侵染小鼠3T6细胞的过程,抗体中和实验显示螺原体经ALP多抗血清30 ℃孵育1 h后,再感染3T6细胞,36 h后进入3T6细胞的螺原体显著少于对照组,其侵染能力明显减弱,说明黏附蛋白ALP这一螺原体表面蛋白,在螺原体入侵宿主细胞过程中起着关键作用。5.S.eriochei i 黏附蛋白ALP互作蛋白的筛选及功能鉴定利用酵母双杂交技术筛选了能与螺原体黏附蛋白ALP相互作用的小鼠蛋白,结果显示ALP可以与小鼠中的137个基因片段互作,选择其中的纤连蛋白7(Fibulin7)进行验证,原核重组表达后利用Far-western blotting确认了 ALP与Fibulin7片段(含有两个EGF结构域)的相互作用,激光共聚焦确认ALP与Fibulin7片段可以共定位。人工合成了 Fibulin7的另外两个结构域(EGF结构域:136-172AA和补体控制蛋白CCP结构域:81-134AA),结果显示仅Fibulin7的EGF结构域能与ALP结合,由于EGF结构域与EGF有高度同源性,而EGF是EGFR信号通路重要的上游信号分子,当ALP重组蛋白刺激3T6细胞后,ALP与EGF竞争性结合而使得EGFR通路被抑制。未出生的小鼠、新生乳鼠和乳鼠期接种螺原体后成年患白内障的小鼠体内都检测出Fibulin7基因的表达,而正常成年小鼠则没有,新生乳鼠大脑部位含有丰富的EGF,ALP通过与EGF的互作促成了 S.eriocheiris对乳鼠的感染。本实验证实S.eriocheiri 外膜蛋白ALP在其侵染哺乳动物细胞中起关键作用。FBLN7蛋白的EGF结构域是ALP作用的识别位点,ALP通过与EGF结构域结合进而与宿主细胞相结合,ALP促进了病原菌与宿主细胞的黏附及后续的侵染过程。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S945
【部分图文】：
来进行细胞死亡的判断。用碘化丙啶（ＰＩ）进行细胞染色，在荧光显微镜的激发下，??正常贴壁的细胞没有出现任何颜色，漂浮着的细胞显现出红色，表明这些细胞已??经死亡（如图２．１）。??Ｍ??图２．１⑷正常３Ｔ６细胞；（Ｂ）中华绒螯蟹螺原体感染３Ｔ６细胞２４ｈ；?（Ｃ）用碘化丙啶（ＰＩ）染色??感染螺原体２４?ｈ后的３Ｔ６细胞，死亡细胞被染成红色，而活细胞不能被染色（２〇ｘ）。标尺：??２０?ｊｉｍ〇??Ｆｉｇ．?２．１?（Ａ）?ｎｏｒｍａｌ?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ；?（Ｂ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ；?（Ｃ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ??ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ，?ａｐｏｐｔｏｔｉｃ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ?ｉｏｄｉｄｅ?（ＰＩ）??ｓｔａｉｎ．?Ｂａｒ：?２０?｜ａｍ??用流式细胞技术来分析诱导３Ｔ６细胞凋亡的情况，结果如图??２．２Ａ所示，Ｓ：?ｍｋ／ｚｅ／Ｗｓ感染３Ｔ６细胞４８?ｈ后能明显的诱导细胞凋亡。样品经??过Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ和ＰＩ双重染色标记后，定量分析结果如图２．２Ｃ、Ｄ所示，与对照??组相比，Ｘ?ｅｈｏｃ／ｚｅ／ｒｋ病原菌刺激３Ｔ６细胞４８?ｈ后凋亡细胞的百分率显著增加（ｐ??＜０．０５）。如图２．２Ｅ所示，细胞活力也明显低于对照组（无病原菌刺激）。??２７??
来进行细胞死亡的判断。用碘化丙啶（ＰＩ）进行细胞染色，在荧光显微镜的激发下，??正常贴壁的细胞没有出现任何颜色，漂浮着的细胞显现出红色，表明这些细胞已??经死亡（如图２．１）。??Ｍ??图２．１⑷正常３Ｔ６细胞；（Ｂ）中华绒螯蟹螺原体感染３Ｔ６细胞２４ｈ；?（Ｃ）用碘化丙啶（ＰＩ）染色??感染螺原体２４?ｈ后的３Ｔ６细胞，死亡细胞被染成红色，而活细胞不能被染色（２〇ｘ）。标尺：??２０?ｊｉｍ〇??Ｆｉｇ．?２．１?（Ａ）?ｎｏｒｍａｌ?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ；?（Ｂ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ；?（Ｃ）?３Ｔ６?ｃｅｌｌｓ??ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ?Ｓ．?ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ，?ａｐｏｐｔｏｔｉｃ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ?ｉｏｄｉｄｅ?（ＰＩ）??ｓｔａｉｎ．?Ｂａｒ：?２０?｜ａｍ??用流式细胞技术来分析诱导３Ｔ６细胞凋亡的情况，结果如图??２．２Ａ所示，Ｓ：?ｍｋ／ｚｅ／Ｗｓ感染３Ｔ６细胞４８?ｈ后能明显的诱导细胞凋亡。样品经??过Ａｎｎｅｘｉｎ?Ｖ和ＰＩ双重染色标记后，定量分析结果如图２．２Ｃ、Ｄ所示，与对照??组相比，Ｘ?ｅｈｏｃ／ｚｅ／ｒｋ病原菌刺激３Ｔ６细胞４８?ｈ后凋亡细胞的百分率显著增加（ｐ??＜０．０５）。如图２．２Ｅ所示，细胞活力也明显低于对照组（无病原菌刺激）。??２７??
结合（ｐｕｒｉｎｅ?ｒｍｃｌｅ６ｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）２１％、核糖核苷酸结合（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）和喔??呤核糖核苷酸结合（ｐｕｒｉｎｅ?ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ｂｉｎｄｉｎｇ）各?２０％、ＫＮＡ?结合（ＲＮＡ??ｂｉｎｄｉｎｇ）１０°／〇等共７个分类。具体分析情况见下图（
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本文编号：
2891825
