鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25编码蛋白的免疫原性及其与细胞相互作用受体蛋白的筛选
发布时间：2020-12-03 16:43
鲫造血器官坏死症,又名鲫疱疹病毒病,是一种由鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）引起的高度传染性水生动物病毒性疾病（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）。鲫造血器官坏死症流行范围广,传播速度快,致死率高,严重威胁鲫养殖产业的健康发展。目前,围绕该病致病机理与防治方法方面的研究越来越受到关注。本研究:1)比较了13株不同地区来源CyHV-2分离株的部分基因序列,包括ORF25、ORF25B、ORF25D、ORF55和ORF72;2)分析了CyHV-2 ORF25基因序列的抗原表位、疏水区及亲水区位点,利用原核表达系统对CyHV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗CyHV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了表达蛋白的免疫原性;3)利用毕赤酵母表达系统表达了CyHV-2 ORF25截短基因编码蛋白,并通过病毒复制抑制、胶体金免疫电镜、血清中和试验、免疫保护力测定等实验研究了表达蛋白的免疫原性;4)采用酵母双杂交系统初步筛选出CyHV-2 ORF25编码蛋白与异育银鲫脑组织细胞（Gibel carp b...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：128 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略表 （按字母顺序排列）
第一章 文献综述
1.1 鲤疱疹病毒Ⅱ型研究进展
1.1.1 流行病学
1.1.2 病原学
1.1.3 诊断与检测方法
1.1.4 防治措施
1.2 病毒感染宿主细胞的分子机制
1.3 酵母双杂交技术及其在水生动物病毒研究中的应用
第二章 不同地区来源CyHV-2分离株部分基因序列比较分析
2.1 研究目的与意义
2.2 实验材料
2.2.1 病料样品
2.2.2 菌株与质粒
2.2.3 主要试剂
2.2.4 主要耗材
2.2.5 主要实验仪器设备
2.3 实验方法
2.3.1 PCR引物设计
2.3.2 病毒DNA的提取
2.3.3 CyHV-2PCR检测
2.3.4 CyHV-2部分基因片段扩增
2.3.5 目的片段连接T载体及测序
2.4 结果与分析
2.4.1 13株不同地区来源的CyHV-2鉴定
2.4.2 CyHV-2 ORF25基因序列分析
2.4.3 CyHV-2 ORF72基因序列分析
2.4.4 CyHV-2 ORF55部分基因序列分析
2.4.5 CyHV-2 ORF25B部分基因序列分析
2.4.6 CyHV-2 ORF25D部分基因序列分析
2.5 讨论
第三章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的原核表达及免疫原性分析
3.1 研究目的与意义
3.2 实验材料
3.2.1 实验鱼及饲养条件
3.2.2 病毒与细胞系
3.2.3 菌株与质粒
3.2.4 主要试剂
3.2.5 主要耗材
3.2.6 主要实验仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 CyHV-2在GiCB细胞中的增殖
3.3.2 CyHV-2病毒DNA的提取
3.3.3 CyHV-2 ORF25截短表达基因序列的选择
3.3.4 PCR引物设计
3.3.5 PCR扩增目的基因
3.3.6 PCR产物的电泳检测及纯化
3.3.7 目的片段连接T载体及测序
3.3.8 原核表达载体的构建
3.3.9 重组蛋白的诱导表达
3.3.10 重组蛋白的处理
3.3.11 重组蛋白的纯化
3.3.12 多克隆抗体制备及效价测定
3.3.13 Westernblot分析
3.3.14 间接免疫荧光检测
3.3.15 重组蛋白免疫保护率测定
3.3.16 数据分析
3.4 结果
3.4.1 CyHV-2 ORF25截短表达基因序列的选择
3.4.2 CyHV-2 ORF25基因克隆
3.4.3 CyHV-2 ORF25基因T载体构建
3.4.4 重组表达载体的构建及鉴定
3.4.5 重组蛋白的表达与纯化
3.4.6 重组蛋白多克隆抗体的制备及检测
3.4.7 间接免疫荧光检测
3.4.8 重组蛋白免疫保护率测定
3.5 讨论
第四章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究
4.1 研究目的与意义
4.2 实验材料
4.2.1 实验鱼及饲养条件
4.2.2 病毒与细胞系
4.2.3 菌株与质粒
4.2.4 主要试剂
4.2.5 主要耗材
4.2.6 主要实验仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 CyHV-2 ORF25基因的扩增与纯化
4.3.2 CyHV-2 ORF25基因连接T载体及测序
4.3.3 毕赤酵母表达载体的构建
4.3.4 重组质粒的线性化和回收
4.3.5 电转酵母菌
4.3.6 转化子的筛选及鉴定
4.3.7 重组酵母的甲醇诱导表达
4.3.8 表达产物的观察与分析
4.3.9 纯化产物的特性研究
4.3.10 免疫原的制备
4.3.11 注射免疫
4.3.12 样品采集与处理
4.3.13 中和抗体效价检测
4.3.14 免疫相关基因表达变化
4.3.15 攻毒实验
4.3.16 数据分析
4.4 结果与分析
4.4.1 CyHV-2 ORF25基因克隆与重组质粒构建
4.4.2 表达产物纯化
4.4.3 SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物
4.4.4 免疫电镜观察结果
4.4.5 病毒滴度抑制实验
4.4.6 血清中和抗体效价
4.4.7 免疫相关基因的表达变化
4.4.8 相对免疫保护率
4.5 讨论
第五章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25编码蛋白宿主细胞受体的初步筛选
5.1 研究目的与意义
5.2 实验材料
5.2.1 病毒与细胞系
5.2.2 菌株与质粒
5.2.3 主要试剂
5.2.4 主要耗材
5.2.5 主要实验仪器设备
5.3 实验方法
5.3.1 GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库的构建
5.3.2 CyHV-2 ORF25编码蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定
5.3.3 筛选与CyHV-2 ORF25编码蛋白互作的GiCB细胞受体
5.4 结果与分析
5.4.1 GiCB细胞总RNA的提取
5.4.2 文库质量鉴定
5.4.3 CyHV-2-ORF25片段的扩增结果
5.4.4 重组诱饵质粒双酶切及PCR鉴定
5.4.5 酵母菌株阳性克隆的鉴定
5.4.6 重组菌报告基因表达检测结果
5.4.7 筛选与CyHV-2 ORF25编码蛋白互作的细胞受体
5.4.8 初步验证与CyHV-2 ORF25编码蛋白互作的细胞受体
5.5 讨论
第六章 结论
参考文献
附录
致谢
本文编号：2896425
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：128 页
【学位级别】：博士
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摘要
ABSTRACT
缩略表 （按字母顺序排列）
第一章 文献综述
1.1 鲤疱疹病毒Ⅱ型研究进展
1.1.1 流行病学
1.1.2 病原学
1.1.3 诊断与检测方法
1.1.4 防治措施
1.2 病毒感染宿主细胞的分子机制
1.3 酵母双杂交技术及其在水生动物病毒研究中的应用
第二章 不同地区来源CyHV-2分离株部分基因序列比较分析
2.1 研究目的与意义
2.2 实验材料
2.2.1 病料样品
2.2.2 菌株与质粒
2.2.3 主要试剂
2.2.4 主要耗材
2.2.5 主要实验仪器设备
2.3 实验方法
2.3.1 PCR引物设计
2.3.2 病毒DNA的提取
2.3.3 CyHV-2PCR检测
2.3.4 CyHV-2部分基因片段扩增
2.3.5 目的片段连接T载体及测序
2.4 结果与分析
2.4.1 13株不同地区来源的CyHV-2鉴定
2.4.2 CyHV-2 ORF25基因序列分析
2.4.3 CyHV-2 ORF72基因序列分析
2.4.4 CyHV-2 ORF55部分基因序列分析
2.4.5 CyHV-2 ORF25B部分基因序列分析
2.4.6 CyHV-2 ORF25D部分基因序列分析
2.5 讨论
第三章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的原核表达及免疫原性分析
3.1 研究目的与意义
3.2 实验材料
3.2.1 实验鱼及饲养条件
3.2.2 病毒与细胞系
3.2.3 菌株与质粒
3.2.4 主要试剂
3.2.5 主要耗材
3.2.6 主要实验仪器设备
3.3 实验方法
3.3.1 CyHV-2在GiCB细胞中的增殖
3.3.2 CyHV-2病毒DNA的提取
3.3.3 CyHV-2 ORF25截短表达基因序列的选择
3.3.4 PCR引物设计
3.3.5 PCR扩增目的基因
3.3.6 PCR产物的电泳检测及纯化
3.3.7 目的片段连接T载体及测序
3.3.8 原核表达载体的构建
3.3.9 重组蛋白的诱导表达
3.3.10 重组蛋白的处理
3.3.11 重组蛋白的纯化
3.3.12 多克隆抗体制备及效价测定
3.3.13 Westernblot分析
3.3.14 间接免疫荧光检测
3.3.15 重组蛋白免疫保护率测定
3.3.16 数据分析
3.4 结果
3.4.1 CyHV-2 ORF25截短表达基因序列的选择
3.4.2 CyHV-2 ORF25基因克隆
3.4.3 CyHV-2 ORF25基因T载体构建
3.4.4 重组表达载体的构建及鉴定
3.4.5 重组蛋白的表达与纯化
3.4.6 重组蛋白多克隆抗体的制备及检测
3.4.7 间接免疫荧光检测
3.4.8 重组蛋白免疫保护率测定
3.5 讨论
第四章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究
4.1 研究目的与意义
4.2 实验材料
4.2.1 实验鱼及饲养条件
4.2.2 病毒与细胞系
4.2.3 菌株与质粒
4.2.4 主要试剂
4.2.5 主要耗材
4.2.6 主要实验仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 CyHV-2 ORF25基因的扩增与纯化
4.3.2 CyHV-2 ORF25基因连接T载体及测序
4.3.3 毕赤酵母表达载体的构建
4.3.4 重组质粒的线性化和回收
4.3.5 电转酵母菌
4.3.6 转化子的筛选及鉴定
4.3.7 重组酵母的甲醇诱导表达
4.3.8 表达产物的观察与分析
4.3.9 纯化产物的特性研究
4.3.10 免疫原的制备
4.3.11 注射免疫
4.3.12 样品采集与处理
4.3.13 中和抗体效价检测
4.3.14 免疫相关基因表达变化
4.3.15 攻毒实验
4.3.16 数据分析
4.4 结果与分析
4.4.1 CyHV-2 ORF25基因克隆与重组质粒构建
4.4.2 表达产物纯化
4.4.3 SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物
4.4.4 免疫电镜观察结果
4.4.5 病毒滴度抑制实验
4.4.6 血清中和抗体效价
4.4.7 免疫相关基因的表达变化
4.4.8 相对免疫保护率
4.5 讨论
第五章 鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25编码蛋白宿主细胞受体的初步筛选
5.1 研究目的与意义
5.2 实验材料
5.2.1 病毒与细胞系
5.2.2 菌株与质粒
5.2.3 主要试剂
5.2.4 主要耗材
5.2.5 主要实验仪器设备
5.3 实验方法
5.3.1 GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库的构建
5.3.2 CyHV-2 ORF25编码蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定
5.3.3 筛选与CyHV-2 ORF25编码蛋白互作的GiCB细胞受体
5.4 结果与分析
5.4.1 GiCB细胞总RNA的提取
5.4.2 文库质量鉴定
5.4.3 CyHV-2-ORF25片段的扩增结果
5.4.4 重组诱饵质粒双酶切及PCR鉴定
5.4.5 酵母菌株阳性克隆的鉴定
5.4.6 重组菌报告基因表达检测结果
5.4.7 筛选与CyHV-2 ORF25编码蛋白互作的细胞受体
5.4.8 初步验证与CyHV-2 ORF25编码蛋白互作的细胞受体
5.5 讨论
第六章 结论
参考文献
附录
致谢
本文编号：2896425
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