杀香鱼假单胞菌鱼体内分布及其溶血素相关蛋白Hcp的克
发布时间：2020-12-10 11:22
大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国海水养殖的重要经济鱼类之一,因其营养丰富、肉质鲜美一直受到消费者的青睐。但是近年来,随着养殖规模的不断扩大,大黄鱼产业结构的升级与发展,大黄鱼的病害已成为制约大黄鱼养殖产业发展的主要屏障。大黄鱼“内脏白点病”是近年影响大黄鱼养殖的重要细菌性疾病。本研究通过人工回感实验,运用组织病理切片与免疫组化技术观察了大黄鱼“内脏白点病”病原——杀香鱼假单胞菌在大黄鱼体内的分布情况;对杀香鱼假单胞菌的溶血素共调节蛋白基因Hcp进行克隆、表达,并获得了以包涵体形式的重组蛋白Hcp,通过蛋白复性后成功获得可溶性蛋白,可运用于杀香鱼假单胞菌T6SS分泌系统中溶血素共调节蛋白Hcp深层研究。对健康大黄鱼进行杀香鱼假单胞菌人工感染试验,结果大黄鱼表现出了典型的“内脏白点病”的症状:病鱼无活力,反应迟钝。解剖发现脾、肾脏、肝脏等内部器官上长满白点,并伴随腹水症状。对发病鱼进行组织病理观察,发病鱼肝、脾、肾等内脏组织都出现明显损伤,表现出不同程度的充血、出血、坏死等,随着菌体在大黄鱼体内大量增殖,大黄鱼全身多器官组织的细胞出现坏死溶解,最终导致感染鱼因多组织器...
【文章来源】：浙江海洋大学浙江省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
T6SS分泌系统模型
孵育盒后 4℃冰箱过夜。切片放入 PBS 缓冲液中清洗 3min 后晾干液体后滴加 70μL 羊抗兔 IgG 聚合物，37℃培养箱内孵育液洗涤 3min 后换液，重复 3 次。染色：滴加适量 DAB 显色剂，室温显色 5-20min，蒸馏水终止染液中染色 40s，水洗 1min。1%盐酸酒精溶液分化 3s，流水漂洗。封片：切片依次放入 85%乙醇，95%乙醇各 1min，无水乙置于二甲苯 I、II 各 2min。使用中性树胶封片，利用显微镜拍感试验结果鱼注射 24 h 后出现游动缓慢，应激反应迟钝等临床症状；注射现死亡，试验进行至 10d 时试验组所有大黄鱼均死亡。对照组表无溃疡等症状，主要是鳃充血，部分鱼吻部充血。剖解病死充血严重，脾脏布满白色小结节，其中肾脏白色结节较脾脏大
图 2-2 病鱼脾脏中病原菌分离培养(左：TCBS 培养基；右：TSA 培养基)Fig.2-2 Isolation and culture of pathogenic bacteria from the spleen of Pseudosciaena crocea (left:TCBS medium; right: TSA medium)3.2 组织病理学变化及特征观察临床解剖观察显示试验组感染鱼的肝、脾、肾等内脏组织与器官都表现出不同程度的充血、出血、坏死等。肝细胞发生广泛性变性，坏死、溶解，有大量的炎性细胞浸润；肾小管上皮细胞肿胀变性，肾间质巨唾细胞和中性粒细胞浸润、严重空泡变性、坏死崩解；脾脏少量含铁血黄素的沉积，淋巴细胞坏死，中性粒细胞和大量巨噬细胞浸润。感染鱼肝脏充血，肝血窦与中央静脉瘀血更清晰，肝血窦、中央静脉以及一些肝细胞内可发现病原菌；肝细胞肿胀明显，肝板排列不齐，其中病变严重的区域失去原有网状支架结构，形成坏死灶。细胞核固缩，细胞质染色变深呈嗜碱性，细胞结构被破坏，空泡化严重。其中坏死灶中心区内充满解体后的细胞碎片，部分肝细胞肝细胞其器官功能受到严重破坏。
【参考文献】：
期刊论文
[1]大黄鱼主要致病菌拮抗菌株的分离鉴定、抑菌谱及安全性分析[J]. 傅超英,王建平,孙琛,陈琳,钱冬. 生物技术通报. 2019(01)
[2]大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病的组织病理和超微病理分析[J]. 张丹枫,安树伟,周素明,王国良. 渔业科学进展. 2017(04)
[3]2014—2016年浙江省大黄鱼养殖病害测报及防治建议[J]. 曹飞飞,朱凝瑜,郑晓叶. 浙江农业科学. 2017(06)
[4]水貂出血性肺炎的诊断与防治[J]. 姜旭东. 中国畜牧兽医文摘. 2017(04)
[5]大黄鱼致病香鱼假单胞菌对环境因子的响应及其感染检测的分析[J]. 袁雪梅,葛明峰,安树伟,张继挺,陶震,王国良. 应用海洋学学报. 2015(04)
[6]大黄鱼内脏白点病病原杀香鱼假单胞菌及其毒力因子研究进展[J]. 张杰,毛芝娟. 浙江万里学院学报. 2015(06)
[7]大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病病原分离鉴定及致病性研究[J]. 胡娇,张飞,徐晓津,苏永全,覃映雪,马英,张艺,韩坤煌,鄢庆枇. 海洋与湖沼. 2014(02)
[8]猪溶血性链球菌的分离鉴定及溶血素基因的PCR检测[J]. 徐珊珊,黄仆,刘涛,代洪波,吴云飞,刘孟良,朱玲. 黑龙江畜牧兽医. 2012(07)
[9]我国大黄鱼产业的发展现状与对策[J]. 刘家富,韩坤煌. 福建水产. 2011(05)
[10]细菌Ⅵ型分泌系统的研究进展[J]. 李俊,俞盈,王豪举. 微生物学报. 2011(03)
博士论文
[1]铜绿假单胞菌T6SS效应蛋白Tse1、Tse3及其免疫蛋白Tsi1、Tsi3结构与功能的研究[D]. 卢德芬.山东大学 2013
[2]鳗弧菌Ⅵ型分泌系统（T6SS）的功能及调控研究[D]. 郝彬.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2012
[3]迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统（T3SS）输送器蛋白及分子伴侣的研究[D]. 王波.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2009
硕士论文
[1]六型分泌系统在猪源肠外致病性大肠杆菌引起宿主天然免疫过程中的作用研究[D]. 于菲菲.华中农业大学 2018
[2]恶臭假单胞菌KT2442鞭毛关键调控基因对菌株生物学特性的影响[D]. 王雨舟.江南大学 2018
[3]病原菌中六型分泌系统相关蛋白Hcp的结构与功能研究[D]. 林清鹏.中国科学技术大学 2017
[4]单环刺螠纤溶酶的重组表达及活性研究[D]. 孙雪燕.中国海洋大学 2015
[5]肠外致病性大肠杆菌VI型分泌系统的功能研究[D]. 寿琎.华中农业大学 2013
[6]大黄鱼内脏白点病的病原及组织病理研究[D]. 安树伟.宁波大学 2013
[7]禾谷镰孢菌β-微管蛋白的原核表达、复性纯化和单克隆抗体的制备[D]. 张聪.南京农业大学 2009
[8]对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP33的功能研究和非结构蛋白wsv406的初步鉴定[D]. 林易.厦门大学 2008
本文编号：2908609
【文章来源】：浙江海洋大学浙江省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
T6SS分泌系统模型
孵育盒后 4℃冰箱过夜。切片放入 PBS 缓冲液中清洗 3min 后晾干液体后滴加 70μL 羊抗兔 IgG 聚合物，37℃培养箱内孵育液洗涤 3min 后换液，重复 3 次。染色：滴加适量 DAB 显色剂，室温显色 5-20min，蒸馏水终止染液中染色 40s，水洗 1min。1%盐酸酒精溶液分化 3s，流水漂洗。封片：切片依次放入 85%乙醇，95%乙醇各 1min，无水乙置于二甲苯 I、II 各 2min。使用中性树胶封片，利用显微镜拍感试验结果鱼注射 24 h 后出现游动缓慢，应激反应迟钝等临床症状；注射现死亡，试验进行至 10d 时试验组所有大黄鱼均死亡。对照组表无溃疡等症状，主要是鳃充血，部分鱼吻部充血。剖解病死充血严重，脾脏布满白色小结节，其中肾脏白色结节较脾脏大
图 2-2 病鱼脾脏中病原菌分离培养(左：TCBS 培养基；右：TSA 培养基)Fig.2-2 Isolation and culture of pathogenic bacteria from the spleen of Pseudosciaena crocea (left:TCBS medium; right: TSA medium)3.2 组织病理学变化及特征观察临床解剖观察显示试验组感染鱼的肝、脾、肾等内脏组织与器官都表现出不同程度的充血、出血、坏死等。肝细胞发生广泛性变性，坏死、溶解，有大量的炎性细胞浸润；肾小管上皮细胞肿胀变性，肾间质巨唾细胞和中性粒细胞浸润、严重空泡变性、坏死崩解；脾脏少量含铁血黄素的沉积，淋巴细胞坏死，中性粒细胞和大量巨噬细胞浸润。感染鱼肝脏充血，肝血窦与中央静脉瘀血更清晰，肝血窦、中央静脉以及一些肝细胞内可发现病原菌；肝细胞肿胀明显，肝板排列不齐，其中病变严重的区域失去原有网状支架结构，形成坏死灶。细胞核固缩，细胞质染色变深呈嗜碱性，细胞结构被破坏，空泡化严重。其中坏死灶中心区内充满解体后的细胞碎片，部分肝细胞肝细胞其器官功能受到严重破坏。
【参考文献】：
期刊论文
[1]大黄鱼主要致病菌拮抗菌株的分离鉴定、抑菌谱及安全性分析[J]. 傅超英,王建平,孙琛,陈琳,钱冬. 生物技术通报. 2019(01)
[2]大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病的组织病理和超微病理分析[J]. 张丹枫,安树伟,周素明,王国良. 渔业科学进展. 2017(04)
[3]2014—2016年浙江省大黄鱼养殖病害测报及防治建议[J]. 曹飞飞,朱凝瑜,郑晓叶. 浙江农业科学. 2017(06)
[4]水貂出血性肺炎的诊断与防治[J]. 姜旭东. 中国畜牧兽医文摘. 2017(04)
[5]大黄鱼致病香鱼假单胞菌对环境因子的响应及其感染检测的分析[J]. 袁雪梅,葛明峰,安树伟,张继挺,陶震,王国良. 应用海洋学学报. 2015(04)
[6]大黄鱼内脏白点病病原杀香鱼假单胞菌及其毒力因子研究进展[J]. 张杰,毛芝娟. 浙江万里学院学报. 2015(06)
[7]大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病病原分离鉴定及致病性研究[J]. 胡娇,张飞,徐晓津,苏永全,覃映雪,马英,张艺,韩坤煌,鄢庆枇. 海洋与湖沼. 2014(02)
[8]猪溶血性链球菌的分离鉴定及溶血素基因的PCR检测[J]. 徐珊珊,黄仆,刘涛,代洪波,吴云飞,刘孟良,朱玲. 黑龙江畜牧兽医. 2012(07)
[9]我国大黄鱼产业的发展现状与对策[J]. 刘家富,韩坤煌. 福建水产. 2011(05)
[10]细菌Ⅵ型分泌系统的研究进展[J]. 李俊,俞盈,王豪举. 微生物学报. 2011(03)
博士论文
[1]铜绿假单胞菌T6SS效应蛋白Tse1、Tse3及其免疫蛋白Tsi1、Tsi3结构与功能的研究[D]. 卢德芬.山东大学 2013
[2]鳗弧菌Ⅵ型分泌系统（T6SS）的功能及调控研究[D]. 郝彬.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2012
[3]迟缓爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统（T3SS）输送器蛋白及分子伴侣的研究[D]. 王波.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2009
硕士论文
[1]六型分泌系统在猪源肠外致病性大肠杆菌引起宿主天然免疫过程中的作用研究[D]. 于菲菲.华中农业大学 2018
[2]恶臭假单胞菌KT2442鞭毛关键调控基因对菌株生物学特性的影响[D]. 王雨舟.江南大学 2018
[3]病原菌中六型分泌系统相关蛋白Hcp的结构与功能研究[D]. 林清鹏.中国科学技术大学 2017
[4]单环刺螠纤溶酶的重组表达及活性研究[D]. 孙雪燕.中国海洋大学 2015
[5]肠外致病性大肠杆菌VI型分泌系统的功能研究[D]. 寿琎.华中农业大学 2013
[6]大黄鱼内脏白点病的病原及组织病理研究[D]. 安树伟.宁波大学 2013
[7]禾谷镰孢菌β-微管蛋白的原核表达、复性纯化和单克隆抗体的制备[D]. 张聪.南京农业大学 2009
[8]对虾白斑综合症病毒膜蛋白VP33的功能研究和非结构蛋白wsv406的初步鉴定[D]. 林易.厦门大学 2008
本文编号：2908609
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