盐酸吗啉胍抗草鱼呼肠孤病毒研究
发布时间：2020-12-12 14:34
草鱼养殖作为我国养殖产量最高的渔业产业为满足人类的蛋白食品需求提供了重要保障,但是长期以来的高密度养殖方式造成了草鱼出血病的频繁暴发并引起巨大的经济损失。目前草鱼出血病的疫苗防治研究虽取得了较大进展,但草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）频繁变异和疫苗商业化大规模应用瓶颈制约了病害防治研究应用进程,采用药物进行防治目前尚为大规模防治草鱼出血病的最为直接有效的途径。因此,抗病毒药物开发以及相关机制研究在草鱼出血病防治领域显得尤为重要。盐酸吗啉胍（Moroxydine hydrochloride,Mor）作为双胍结构药物因缺乏确切的药理学和毒理学研究证据在1999年被国家宣布停用,该药物一直以来未受重视。本研究前期发现Mor具有良好的抗GCRV活性,因此在对其进行安全性进行检测前提下,进一步对Mor的抗病毒和抗细胞凋亡等机制进行研究。取得结果如下:1.Mor体外抗GCRV活性研究通过借助体外抗病毒药物筛选模型,发现Mor对四株水产病毒感染下的体外培养细胞起到了不同程度的保护作用,尤其是在100μg mL-1的初筛试验中实现了对感染两株GCRV病毒的草鱼肾细胞（...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 GCRV研究历史
1.2 草鱼出血病的流行病学概况
1.3 GCRV生物学研究
1.3.1 GCRV形态特征
1.3.2 GCRV理化特性
1.3.3 GCRV的细胞培养及感染特性
1.3.4 GCRV的一般生物学特征
1.3.5 GCRV转录和翻译
1.4 GCRV的检测
1.5 病毒感染对宿主影响研究
1.5.1 水产动物病毒与宿主细胞的关系
1.5.2 GCRV与宿主细胞的相互关系
1.6 草鱼出血病病害防控技术研究
1.6.1 草鱼出血病疫苗免疫
1.6.2 草鱼机体免疫抗GCRV研究
1.6.3 基因干扰技术抑制草鱼出血病
1.6.4 草鱼出血病的生态防控
1.6.5 草鱼出血病药物防控
1.7 Mor抗病毒研究
1.7.1 Mor概述
1.7.2 Mor特性
1.7.3 Mor研究进展
1.8 药物抗病毒途径的相互关系
1.9 选题目的及意义
第二章 Mor体外抗GCRV活性研究
2.1 材料与方法
2.1.1 细胞、病毒和化合物
2.1.2 主要细胞培养基及溶液的配制
2.1.3 细胞的复苏与培养
2.1.4 病毒扩增与滴度
2.1.5 Mor抗病毒处理后对细胞活力检测
2.1.6 药物对细胞的安全性检测
2.1.7 Mor在CIK细胞的药物代谢检测
2.1.8 Mor抗GCRV病毒对宿主细胞的形态学检测
2.1.9 Mor抗GCRV病毒效果的浓度梯度检测
2.1.10 Mor处理后对病毒滴度的检测
2.1.11 Mor处理后对病毒基因表达的检测
2.1.12 Mor处理后对GCRV病毒蛋白表达的检测
2.2 结果与分析
2.2.1 Mor对GCRV病毒的体外抗病毒活性
2.2.2 Mor对细胞的急性毒性
2.2.3 Mor在CIK细胞内的代谢作用
2.2.4 Mor抗GCRV病毒对宿主细胞的形态学检测
2.2.5 Mor抗GCRV的浓度梯度检测结果
2.2.6 Mor处理后对病毒滴度的影响
2.2.7 Mor处理后对病毒基因表达的影响
2.2.8 Mor对GCRV病毒蛋白表达的抑制
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 Mor在体抗GCRV研究
3.1 材料与方法
3.1.1 实验动物
3.1.2 药物对草鱼的安全性
3.1.3 病毒攻毒及药物处理
3.1.4 Mor抗病毒效果检测
3.1.5 Mor抗病毒过程中对草鱼血液酶活检测
3.2 结果
3.2.1 Mor对草鱼的急性毒性
3.2.2 Mor处理后对草鱼死亡率的保护
3.2.3 药物浸泡和注射下对草鱼组织内GCRV的检测
3.2.4 药物注射处理下对草鱼相关生理指标测定
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 Mor抑制GCRV蛋白表达
4.1 材料与方法
4.1.1 GCRV104病毒VP6目的基因扩增与回收
4.1.2 重组克隆质粒的构建与鉴定
4.1.3 重组表达载体的构建与鉴定
4.1.4 Mor对重组质粒在CIK细胞内的表达的荧光检测
4.1.5 重组质粒转染CIK细胞后对宿主细胞活力的检测
4.1.6 重组质粒转染CIK细胞后对宿主凋亡的流式细胞检测
4.1.7 Mor对重组质粒转染CIK细胞后VP6表达的影响
4.2 实验结果与分析
4.2.1 GCRV病毒VP6基因的扩增与鉴定
4.2.2 VP6基因真核表达载体酶切和测序鉴定
4.2.3 Mor 作用下对重组质粒在 CIK 细胞内表达的影响
4.2.4 pIRES2-AcGFP1-VP6转染后对CIK细胞活力的影响
4.2.5 pIRES2-AcGFP1-VP6转染后对CIK细胞凋亡的影响
4.2.6 Mor 对转染细胞内 VP6 表达的影响
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 Mor抗CIK细胞凋亡机制研究
5.1 材料与方法
5.1.1 Mor处理后对防止细胞核损伤的检测
5.1.2 Mor处理后对防止DNA损伤的分子检测
5.1.3 Mor对细胞表面超微结构的检测
5.1.4 Mor抑制GCRV粒子在细胞内的复制以及抗凋亡检测
5.1.5 凋亡抑制剂作用下的细胞活力检测
5.1.6 分光光度法检测Caspase 3 的相对活性
5.1.7 Caspase- 9、-3 的Western-blot检测
5.1.8 GCRV感染对Bax和Bcl-2 蛋白表达的检测
5.2 结果
5.2.1 Mor处理后对防止细胞核损伤的检测
5.2.2 Mor处理后对防止DNA断裂的检测
5.2.3 Mor处理后对细胞表面形态的影响
5.2.4 Mor处理后对细胞内部形态的影响
5.2.5 GCRV感染对Caspase 3 酶活性的影响
5.2.6 Mor作用下对线粒体凋亡通路的影响
5.3 讨论
5.4 小结
第六章 Mor对宿主免疫反应的调控作用
6.1 材料与方法
6.1.1 Mor处理后对宿主细胞免疫基因表达的检测
6.1.2 Mor抗病毒过程中对草鱼免疫影响试验
6.2 实验结果与分析
6.2.1 Mor处理后对CIK细胞免疫基因表达的影响
6.2.2 药物注射处理下对草鱼体内免疫基因表达的影响
6.3 讨论
6.4 小结
结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]预防和控制草鱼出血病的主要措施[J]. 姜志勇,翁如柏,郭晓奇,吴郁丽. 海洋与渔业. 2016(07)
[2]水产动物的病毒基因组及其病毒与宿主的相互作用[J]. 张奇亚,桂建芳. 中国科学:生命科学. 2014(12)
[3]盐酸吗啉胍的药理活性及其检测方法的研究进展[J]. 方艳艳. 中国医药指南. 2014(30)
[4]Suppression of RNA Interference Pathway in vitro by Grass Carp Reovirus[J]. Shuai Guo1#, Dan Xu1#, Hong-xu Xu2, Tu Wang1, Jia-le Li1 and Li-qun Lu1** (1. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization /Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China). Virologica Sinica. 2012(02)
[5]草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果[J]. 刘林,徐诗英,李婧慧,邹勇,倪金俤,杨鸢劼,曹广力,薛仁宇,陈辉,贡成良. 水产学报. 2012(03)
[6]HPLC法测定盐酸吗啉胍滴眼液的含量[J]. 盛夏. 安徽医药. 2011(12)
[7]体外抗草鱼呼肠孤病毒药物筛选细胞模型的建立[J]. 安伟,曾令兵,周勇,徐进,范玉顶,肖艺. 中国兽医科学. 2011(09)
[8]一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析[J]. 曾伟伟,王庆,刘永奎,张乐生,刘宝芹,石存斌,吴淑勤. 水生生物学报. 2011(05)
[9]草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定[J]. 郝贵杰,沈锦玉,潘晓艺,徐洋,姚嘉赟,尹文林. 渔业科学进展. 2011(01)
[10]利巴韦林注射液体内外抗流感病毒作用研究[J]. 高荣梅,李兴琼,何维英,蒋建东,李玉环. 药学学报. 2010(03)
博士论文
[1]碳纳米管载药系统构建及其对草鱼出血病防控研究[D]. 朱斌.西北农林科技大学 2015
[2]RNA基因干扰技术抑制草鱼呼肠孤病毒复制的研究[D]. 马杰.华中农业大学 2013
硕士论文
[1]三株不同基因型草鱼呼肠孤病毒生物学特性的差异分析[D]. 殷亮.上海海洋大学 2014
[2]草鱼呼肠孤病毒微载体培养技术与灭活疫苗浸泡免疫效果研究[D]. 刘秋凤.上海海洋大学 2013
[3]草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7核酸疫苗的研究[D]. 徐诗英.南京师范大学 2012
[4]锦鲤疱疹病毒ORF72和TK基因原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定[D]. 余剑敏.华中农业大学 2011
本文编号：2912741
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 GCRV研究历史
1.2 草鱼出血病的流行病学概况
1.3 GCRV生物学研究
1.3.1 GCRV形态特征
1.3.2 GCRV理化特性
1.3.3 GCRV的细胞培养及感染特性
1.3.4 GCRV的一般生物学特征
1.3.5 GCRV转录和翻译
1.4 GCRV的检测
1.5 病毒感染对宿主影响研究
1.5.1 水产动物病毒与宿主细胞的关系
1.5.2 GCRV与宿主细胞的相互关系
1.6 草鱼出血病病害防控技术研究
1.6.1 草鱼出血病疫苗免疫
1.6.2 草鱼机体免疫抗GCRV研究
1.6.3 基因干扰技术抑制草鱼出血病
1.6.4 草鱼出血病的生态防控
1.6.5 草鱼出血病药物防控
1.7 Mor抗病毒研究
1.7.1 Mor概述
1.7.2 Mor特性
1.7.3 Mor研究进展
1.8 药物抗病毒途径的相互关系
1.9 选题目的及意义
第二章 Mor体外抗GCRV活性研究
2.1 材料与方法
2.1.1 细胞、病毒和化合物
2.1.2 主要细胞培养基及溶液的配制
2.1.3 细胞的复苏与培养
2.1.4 病毒扩增与滴度
2.1.5 Mor抗病毒处理后对细胞活力检测
2.1.6 药物对细胞的安全性检测
2.1.7 Mor在CIK细胞的药物代谢检测
2.1.8 Mor抗GCRV病毒对宿主细胞的形态学检测
2.1.9 Mor抗GCRV病毒效果的浓度梯度检测
2.1.10 Mor处理后对病毒滴度的检测
2.1.11 Mor处理后对病毒基因表达的检测
2.1.12 Mor处理后对GCRV病毒蛋白表达的检测
2.2 结果与分析
2.2.1 Mor对GCRV病毒的体外抗病毒活性
2.2.2 Mor对细胞的急性毒性
2.2.3 Mor在CIK细胞内的代谢作用
2.2.4 Mor抗GCRV病毒对宿主细胞的形态学检测
2.2.5 Mor抗GCRV的浓度梯度检测结果
2.2.6 Mor处理后对病毒滴度的影响
2.2.7 Mor处理后对病毒基因表达的影响
2.2.8 Mor对GCRV病毒蛋白表达的抑制
2.3 讨论
2.4 小结
第三章 Mor在体抗GCRV研究
3.1 材料与方法
3.1.1 实验动物
3.1.2 药物对草鱼的安全性
3.1.3 病毒攻毒及药物处理
3.1.4 Mor抗病毒效果检测
3.1.5 Mor抗病毒过程中对草鱼血液酶活检测
3.2 结果
3.2.1 Mor对草鱼的急性毒性
3.2.2 Mor处理后对草鱼死亡率的保护
3.2.3 药物浸泡和注射下对草鱼组织内GCRV的检测
3.2.4 药物注射处理下对草鱼相关生理指标测定
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 Mor抑制GCRV蛋白表达
4.1 材料与方法
4.1.1 GCRV104病毒VP6目的基因扩增与回收
4.1.2 重组克隆质粒的构建与鉴定
4.1.3 重组表达载体的构建与鉴定
4.1.4 Mor对重组质粒在CIK细胞内的表达的荧光检测
4.1.5 重组质粒转染CIK细胞后对宿主细胞活力的检测
4.1.6 重组质粒转染CIK细胞后对宿主凋亡的流式细胞检测
4.1.7 Mor对重组质粒转染CIK细胞后VP6表达的影响
4.2 实验结果与分析
4.2.1 GCRV病毒VP6基因的扩增与鉴定
4.2.2 VP6基因真核表达载体酶切和测序鉴定
4.2.3 Mor 作用下对重组质粒在 CIK 细胞内表达的影响
4.2.4 pIRES2-AcGFP1-VP6转染后对CIK细胞活力的影响
4.2.5 pIRES2-AcGFP1-VP6转染后对CIK细胞凋亡的影响
4.2.6 Mor 对转染细胞内 VP6 表达的影响
4.3 讨论
4.4 小结
第五章 Mor抗CIK细胞凋亡机制研究
5.1 材料与方法
5.1.1 Mor处理后对防止细胞核损伤的检测
5.1.2 Mor处理后对防止DNA损伤的分子检测
5.1.3 Mor对细胞表面超微结构的检测
5.1.4 Mor抑制GCRV粒子在细胞内的复制以及抗凋亡检测
5.1.5 凋亡抑制剂作用下的细胞活力检测
5.1.6 分光光度法检测Caspase 3 的相对活性
5.1.7 Caspase- 9、-3 的Western-blot检测
5.1.8 GCRV感染对Bax和Bcl-2 蛋白表达的检测
5.2 结果
5.2.1 Mor处理后对防止细胞核损伤的检测
5.2.2 Mor处理后对防止DNA断裂的检测
5.2.3 Mor处理后对细胞表面形态的影响
5.2.4 Mor处理后对细胞内部形态的影响
5.2.5 GCRV感染对Caspase 3 酶活性的影响
5.2.6 Mor作用下对线粒体凋亡通路的影响
5.3 讨论
5.4 小结
第六章 Mor对宿主免疫反应的调控作用
6.1 材料与方法
6.1.1 Mor处理后对宿主细胞免疫基因表达的检测
6.1.2 Mor抗病毒过程中对草鱼免疫影响试验
6.2 实验结果与分析
6.2.1 Mor处理后对CIK细胞免疫基因表达的影响
6.2.2 药物注射处理下对草鱼体内免疫基因表达的影响
6.3 讨论
6.4 小结
结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]预防和控制草鱼出血病的主要措施[J]. 姜志勇,翁如柏,郭晓奇,吴郁丽. 海洋与渔业. 2016(07)
[2]水产动物的病毒基因组及其病毒与宿主的相互作用[J]. 张奇亚,桂建芳. 中国科学:生命科学. 2014(12)
[3]盐酸吗啉胍的药理活性及其检测方法的研究进展[J]. 方艳艳. 中国医药指南. 2014(30)
[4]Suppression of RNA Interference Pathway in vitro by Grass Carp Reovirus[J]. Shuai Guo1#, Dan Xu1#, Hong-xu Xu2, Tu Wang1, Jia-le Li1 and Li-qun Lu1** (1. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization /Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China). Virologica Sinica. 2012(02)
[5]草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果[J]. 刘林,徐诗英,李婧慧,邹勇,倪金俤,杨鸢劼,曹广力,薛仁宇,陈辉,贡成良. 水产学报. 2012(03)
[6]HPLC法测定盐酸吗啉胍滴眼液的含量[J]. 盛夏. 安徽医药. 2011(12)
[7]体外抗草鱼呼肠孤病毒药物筛选细胞模型的建立[J]. 安伟,曾令兵,周勇,徐进,范玉顶,肖艺. 中国兽医科学. 2011(09)
[8]一株草鱼呼肠孤病毒弱毒株的分离、鉴定及免疫原性初步分析[J]. 曾伟伟,王庆,刘永奎,张乐生,刘宝芹,石存斌,吴淑勤. 水生生物学报. 2011(05)
[9]草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定[J]. 郝贵杰,沈锦玉,潘晓艺,徐洋,姚嘉赟,尹文林. 渔业科学进展. 2011(01)
[10]利巴韦林注射液体内外抗流感病毒作用研究[J]. 高荣梅,李兴琼,何维英,蒋建东,李玉环. 药学学报. 2010(03)
博士论文
[1]碳纳米管载药系统构建及其对草鱼出血病防控研究[D]. 朱斌.西北农林科技大学 2015
[2]RNA基因干扰技术抑制草鱼呼肠孤病毒复制的研究[D]. 马杰.华中农业大学 2013
硕士论文
[1]三株不同基因型草鱼呼肠孤病毒生物学特性的差异分析[D]. 殷亮.上海海洋大学 2014
[2]草鱼呼肠孤病毒微载体培养技术与灭活疫苗浸泡免疫效果研究[D]. 刘秋凤.上海海洋大学 2013
[3]草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP7核酸疫苗的研究[D]. 徐诗英.南京师范大学 2012
[4]锦鲤疱疹病毒ORF72和TK基因原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定[D]. 余剑敏.华中农业大学 2011
本文编号：2912741
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/2912741.html
