利用大肠杆菌构建GCRV基因工程疫苗系统研究
发布时间：2020-12-22 04:47
草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）引起的草鱼出血病（Grass carp hemorrhage）是严重危害草鱼的传染性疾病。但是,草鱼出血病的有效防控仍然存在挑战。疫苗免疫是预防草鱼出血病的有效途径。核酸疫苗具有制备简单、安全性高和免疫应答有效持久等优点,但是作为一种外源物质,易被组织降解、清除,导致其不能长期稳定的发挥免疫效应。在本研究中借助细菌菌蜕技术,以大肠杆菌DH5α为载体,制备了大肠杆菌菌蜕载GCRV vp7核酸疫苗,以提高核酸疫苗的免疫效果为目的,评价菌蜕介导的核酸疫苗对草鱼出血病的防控效果。细菌表面展示疫苗因其具有良好的免疫应答效果使之在疫苗开发中具有优势。本研究借助细菌表面展示技术开发了大肠杆菌表面展示GCRV VP7蛋白疫苗;进一步分别构建了大肠杆菌BL21（DE3）载嗜水气单胞菌外膜A蛋白（Outer membrane protein A,OmpA）、主要黏附素蛋白（Major adhesin,Mah）与VP7蛋白共展示疫苗,以期通过浸浴免疫达到注射免疫抗病效果,对共展示疫苗浸浴特性及其机制进行了初步研究。取得结果如下:1.通过基因重...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
E蛋白裂解革兰氏阴性细菌扫描电镜图（Ebensenetal.2004）
.8 细菌表面展示研究进展8.1 细菌表面展示系统简介细菌细胞表面展示是指利用基因重组手段，将具有特定功能的某一外源蛋白质或，即乘客蛋白（Passenger protein）与一些锚定元件，即载体蛋白（Carrier protein）表达，在锚定元件的作用下，实现外源蛋白直接在细菌表面进行固着的新型 DNA技术，表面展示后，外源的蛋白质或多肽仍然保持了原有的生物活性和相对独立的结构（Benhar 2001）。国内外研究已经报道了多种用于构建细菌表面展示体系的载白如革兰氏阳性菌的自溶素、S 层蛋白和芽胞衣等；革兰氏阴性菌的外膜蛋白、脂、细胞表面附属蛋白、S 层蛋白和自转运蛋白等（Lee et al. 2003; Okano et al. 2008据锚定元件性能和结构的不同，目前主要应用 3 种方式实现两者的融合表达和细菌展示，即 N 末端融合，C 末端融合和三夹板融合（Kuroda et al. 2014）（见图 1-2菌表面展示在重组活菌疫苗的制备，多肽文库构建与筛选等多方面具有广泛的发展（Aoki et al. 2002; Brown 1997; Lu et al. 1995; Lee et al. 2003）（见图 1-3）。下面重绍细菌表面展示在疫苗开发中的应用。
图 1-3 微生物表面展示应用（Lee et al. 2003）Fig. 1-3 Applications of microbial cell surface display (Lee et al. 2003)表面展示在疫苗开发中的应用表面展示疫苗递送系统的研究是细菌表面展示最常见的应用之一。将性抗原展示在一些弱毒或无毒菌株的表面，这些重组菌可以直接作为物或人体，达到抵抗疾病爆发的目的（Samuelson et al. 2002）。相比苗，活菌表面展示疫苗制备简单，抗原无需经过细胞内提取和体外纯过程，还可保护外源抗原在递送过程中免于被降解（Neutra and Kozlo 2010）。此外，利用重组活菌疫苗进行免疫时，细菌表面展示的异源异性抗体应答中具有明显的优势，它将抗原递呈在细菌表面，这样使抗原更容易被免疫系统识别。细菌本身能发挥佐剂的功能，促进抗原原的摄取，单次免疫后也会产生持久的免疫效果（Dertzbathy et al. 2005）。目前，有两种策略用于活菌表面展示疫苗的开发，菌来生产活菌表面展示疫苗，如沙门氏菌和牛分支杆菌等；一种是在品级细菌表面展示外源抗原，如大肠杆菌、乳酸菌和金黄色葡萄球菌
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鱼呼肠孤病毒分子生物学研究进展[J]. 李永刚,曾伟伟,王庆,殷亮,王英英,石存斌,吴淑勤. 动物医学进展. 2013(04)
[2]Antigenic analysis of grass carp reovirus using single-chain variable fragment antibody against IgM from Ctenopharyngodon idella[J]. CHEN CongLin,SUN XiaoYun,LIAO LanJie,LUO ShaoXiang,LI ZhouQuan,ZHANG XiaoHua,WANG YaPing,GUO QionLin,FANG Qin,DAI HePing. Science China(Life Sciences). 2013(01)
[3]草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估[J]. 刘林,徐诗英,李婧慧,邹勇,倪金俤,杨鸢劼,曹广力,薛仁宇,陈辉,贡成良. 中国水产科学. 2012(05)
[4]Suppression of RNA Interference Pathway in vitro by Grass Carp Reovirus[J]. Shuai Guo1#, Dan Xu1#, Hong-xu Xu2, Tu Wang1, Jia-le Li1 and Li-qun Lu1** (1. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization /Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China). Virologica Sinica. 2012(02)
[5]草鱼出血病及其防治技术[J]. 高晓,李兵. 现代农业科技. 2008(20)
[6]草鱼出血病类型及防治方法[J]. 刘堂水,艾桃山,喻运珍. 河北渔业. 2008(02)
[7]嗜水气单胞菌菌蜕的制备及其对银鲫的口服免疫[J]. 储卫华,庄禧懿,陆承平. 微生物学报. 2008(02)
[8]核酸疫苗的研究进展及其在鱼类免疫中的应用[J]. 郝贵杰,沈锦玉,潘晓义. 大连水产学院学报. 2007(02)
[9]草鱼呼肠孤病毒的研究进展[J]. 肖雪,颜其贵,欧洋,曹洪志,樊汶樵,李冰,赖维莉,张传斌,周磊,冯婷,林涛,刘亚. 水利渔业. 2006(05)
[10]草鱼病毒性出血病研究进展[J]. 王方华,李安兴. 南方水产. 2006(03)
博士论文
[1]嗜水气单胞菌非质粒依赖性菌蜕疫苗的研制及评价[D]. 付立霞.南京农业大学 2012
[2]柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）菌蜕疫苗的研究[D]. 祝文兴.山东师范大学 2012
[3]利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究[D]. 李茜茜.华中农业大学 2009
[4]嗜水气单胞菌侵袭机制及其胞外蛋白酶的研究[D]. 储卫华.南京农业大学 2002
硕士论文
[1]副结核分枝杆菌MAP3061c蛋白表面展示疫苗载体的构建及其免疫效力研究[D]. 周薇.黑龙江八一农垦大学 2016
[2]大肠杆菌表面展示结核分枝杆菌PepA、PPE18和EsxH蛋白及其免疫原性研究[D]. 刘松艳.中国农业科学院 2016
[3]嗜水气单胞菌碳纳米管载亚单位疫苗的研制及免疫效果评价[D]. 龚雨鑫.西北农林科技大学 2015
[4]鸡白痢沙门氏菌菌影（Ghost）疫苗的制备及其免疫效力评价[D]. 田秋丰.黑龙江八一农垦大学 2014
[5]草鱼呼肠孤病毒微载体培养技术与灭活疫苗浸泡免疫效果研究[D]. 刘秋凤.上海海洋大学 2013
[6]以人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕为基础的新型HIV核酸疫苗研究[D]. 温晶.中国人民解放军军事医学科学院 2011
[7]减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用研究[D]. 翟伟强.华中农业大学 2011
[8]新型渔用基因工程菌蜕疫苗的研制[D]. 侯贤.山东师范大学 2010
[9]嗜水气单胞菌主要粘附素基因序列及其重组基因表达产物功能分析[D]. 吴学敏.福建农林大学 2010
本文编号：2931157
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
E蛋白裂解革兰氏阴性细菌扫描电镜图（Ebensenetal.2004）
.8 细菌表面展示研究进展8.1 细菌表面展示系统简介细菌细胞表面展示是指利用基因重组手段，将具有特定功能的某一外源蛋白质或，即乘客蛋白（Passenger protein）与一些锚定元件，即载体蛋白（Carrier protein）表达，在锚定元件的作用下，实现外源蛋白直接在细菌表面进行固着的新型 DNA技术，表面展示后，外源的蛋白质或多肽仍然保持了原有的生物活性和相对独立的结构（Benhar 2001）。国内外研究已经报道了多种用于构建细菌表面展示体系的载白如革兰氏阳性菌的自溶素、S 层蛋白和芽胞衣等；革兰氏阴性菌的外膜蛋白、脂、细胞表面附属蛋白、S 层蛋白和自转运蛋白等（Lee et al. 2003; Okano et al. 2008据锚定元件性能和结构的不同，目前主要应用 3 种方式实现两者的融合表达和细菌展示，即 N 末端融合，C 末端融合和三夹板融合（Kuroda et al. 2014）（见图 1-2菌表面展示在重组活菌疫苗的制备，多肽文库构建与筛选等多方面具有广泛的发展（Aoki et al. 2002; Brown 1997; Lu et al. 1995; Lee et al. 2003）（见图 1-3）。下面重绍细菌表面展示在疫苗开发中的应用。
图 1-3 微生物表面展示应用（Lee et al. 2003）Fig. 1-3 Applications of microbial cell surface display (Lee et al. 2003)表面展示在疫苗开发中的应用表面展示疫苗递送系统的研究是细菌表面展示最常见的应用之一。将性抗原展示在一些弱毒或无毒菌株的表面，这些重组菌可以直接作为物或人体，达到抵抗疾病爆发的目的（Samuelson et al. 2002）。相比苗，活菌表面展示疫苗制备简单，抗原无需经过细胞内提取和体外纯过程，还可保护外源抗原在递送过程中免于被降解（Neutra and Kozlo 2010）。此外，利用重组活菌疫苗进行免疫时，细菌表面展示的异源异性抗体应答中具有明显的优势，它将抗原递呈在细菌表面，这样使抗原更容易被免疫系统识别。细菌本身能发挥佐剂的功能，促进抗原原的摄取，单次免疫后也会产生持久的免疫效果（Dertzbathy et al. 2005）。目前，有两种策略用于活菌表面展示疫苗的开发，菌来生产活菌表面展示疫苗，如沙门氏菌和牛分支杆菌等；一种是在品级细菌表面展示外源抗原，如大肠杆菌、乳酸菌和金黄色葡萄球菌
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鱼呼肠孤病毒分子生物学研究进展[J]. 李永刚,曾伟伟,王庆,殷亮,王英英,石存斌,吴淑勤. 动物医学进展. 2013(04)
[2]Antigenic analysis of grass carp reovirus using single-chain variable fragment antibody against IgM from Ctenopharyngodon idella[J]. CHEN CongLin,SUN XiaoYun,LIAO LanJie,LUO ShaoXiang,LI ZhouQuan,ZHANG XiaoHua,WANG YaPing,GUO QionLin,FANG Qin,DAI HePing. Science China(Life Sciences). 2013(01)
[3]草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估[J]. 刘林,徐诗英,李婧慧,邹勇,倪金俤,杨鸢劼,曹广力,薛仁宇,陈辉,贡成良. 中国水产科学. 2012(05)
[4]Suppression of RNA Interference Pathway in vitro by Grass Carp Reovirus[J]. Shuai Guo1#, Dan Xu1#, Hong-xu Xu2, Tu Wang1, Jia-le Li1 and Li-qun Lu1** (1. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization /Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China). Virologica Sinica. 2012(02)
[5]草鱼出血病及其防治技术[J]. 高晓,李兵. 现代农业科技. 2008(20)
[6]草鱼出血病类型及防治方法[J]. 刘堂水,艾桃山,喻运珍. 河北渔业. 2008(02)
[7]嗜水气单胞菌菌蜕的制备及其对银鲫的口服免疫[J]. 储卫华,庄禧懿,陆承平. 微生物学报. 2008(02)
[8]核酸疫苗的研究进展及其在鱼类免疫中的应用[J]. 郝贵杰,沈锦玉,潘晓义. 大连水产学院学报. 2007(02)
[9]草鱼呼肠孤病毒的研究进展[J]. 肖雪,颜其贵,欧洋,曹洪志,樊汶樵,李冰,赖维莉,张传斌,周磊,冯婷,林涛,刘亚. 水利渔业. 2006(05)
[10]草鱼病毒性出血病研究进展[J]. 王方华,李安兴. 南方水产. 2006(03)
博士论文
[1]嗜水气单胞菌非质粒依赖性菌蜕疫苗的研制及评价[D]. 付立霞.南京农业大学 2012
[2]柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）菌蜕疫苗的研究[D]. 祝文兴.山东师范大学 2012
[3]利用冰晶核蛋白构建细菌细胞表面展示体系及其应用研究[D]. 李茜茜.华中农业大学 2009
[4]嗜水气单胞菌侵袭机制及其胞外蛋白酶的研究[D]. 储卫华.南京农业大学 2002
硕士论文
[1]副结核分枝杆菌MAP3061c蛋白表面展示疫苗载体的构建及其免疫效力研究[D]. 周薇.黑龙江八一农垦大学 2016
[2]大肠杆菌表面展示结核分枝杆菌PepA、PPE18和EsxH蛋白及其免疫原性研究[D]. 刘松艳.中国农业科学院 2016
[3]嗜水气单胞菌碳纳米管载亚单位疫苗的研制及免疫效果评价[D]. 龚雨鑫.西北农林科技大学 2015
[4]鸡白痢沙门氏菌菌影（Ghost）疫苗的制备及其免疫效力评价[D]. 田秋丰.黑龙江八一农垦大学 2014
[5]草鱼呼肠孤病毒微载体培养技术与灭活疫苗浸泡免疫效果研究[D]. 刘秋凤.上海海洋大学 2013
[6]以人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕为基础的新型HIV核酸疫苗研究[D]. 温晶.中国人民解放军军事医学科学院 2011
[7]减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用研究[D]. 翟伟强.华中农业大学 2011
[8]新型渔用基因工程菌蜕疫苗的研制[D]. 侯贤.山东师范大学 2010
[9]嗜水气单胞菌主要粘附素基因序列及其重组基因表达产物功能分析[D]. 吴学敏.福建农林大学 2010
本文编号：2931157
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