cfGnRH基因敲除对斑点叉尾鮰繁殖能力的影响
发布时间：2021-02-21 16:23
基因编辑技术是进行基因功能研究的重要工具,类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）技术是近年来发展最为蓬勃的基因编辑技术之一。这种基因编辑技术以其适用范围广、操作较为简便、效率高、成本低等优点,已经在多种生物中成功运用,也在多种鱼类中进行了实践研究,例如斑马鱼（Danio rerio）、青鳉（Oryzias latipes）和黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco）等。基因编辑在改良品种,提高生产效率,治疗疾病等方面具有巨大的潜力。斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）作为美国主要淡水养殖品种之一,近年来其养殖产业在运营成本增高,疾病种类剧增,其他进出口冷冻鱼等多种因素影响下受到了很大的挑战。利用基因编辑技术修改斑点叉尾鮰的基因组成可以极大地提高生产效率,然而,随之而来的问题是由于基因编辑鱼类的泄漏所带来的生态安全隐患。绝育技术可以有效地减小或避免这些隐患。本研究前期利用TALEN和二次电穿孔的技术,在受精卵时期敲除斑点叉尾鮰的鲶鱼型GnRH（Catfish Gona...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
靶向cfGnRH基因的TALEN质粒结构示意图
3.1.3 3 龄时样品的收集和分子鉴定3 龄时，随机抽取斑点叉尾鮰突变型 5 尾，非突变型 6 尾，以及野生型斑点叉尾鮰 4 尾，再次取腹鳍和胡须为样品，依次利用蛋白消化酶 K、蛋白沉淀液和酒精，提取基因组 DNA（Cheng et al., 2014）。接着利用 Roche 高保真 PCR 扩增体系（Roche, Indianapolis, IN）扩增提取的基因组 DNA 中的 cfGnRH 序列片段。突变结果同样是使用 Surveyor Mutation Detection 试剂盒（Integrated DNATechnologies, Coralville, IA）进行检测（Qin et al., 2016）。3.2 实验结果3.2.1 高保真 PCR 和 Surveyor CEL-I 突变存在检测实验利用高保真 PCR 技术成功扩增出靶向部分 cfGnRH 基因的序列片段，其中包括外显子 2、3 和 4，大小为 550bp（图 3-1）。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 - m
3.3 讨论高保真 PCR 体系是 Taq 聚合酶和缺少聚合酶活性的热稳定校正蛋白的混合体。它能够以极高的精确性扩增出达到 5000bp 大小的 DNA 片段。本研究需要检测 DNA 序列的突变情况，因此需要利用高保真 PCR 体系，以尽可能地避免扩增过程中可能出现的碱基错配所带来的突变。CELL-I 突变检测技术以及测序结果显示，TALEN 技术已经成功引起靶位点图 3-3 斑点叉尾鮰的测序结果野生型斑点叉尾鮰的测序结果在第一行中列出。标有下划线的序列代表 TALEN 结合部位；红色字母／破折号代表 cfGnRH 部位的修饰过的脱氧核糖核苷酸。Fig. 3-3 Sequences results of channel catfishThe wild-type (wt) channel catfish cfGnRH gene sequence is shown at the first line. Sequencesunderlined are the TALEN binding sites; red letters/dashes indicate the modified nucleotides ofcfGnRH gene.
本文编号：3044606
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
靶向cfGnRH基因的TALEN质粒结构示意图
3.1.3 3 龄时样品的收集和分子鉴定3 龄时，随机抽取斑点叉尾鮰突变型 5 尾，非突变型 6 尾，以及野生型斑点叉尾鮰 4 尾，再次取腹鳍和胡须为样品，依次利用蛋白消化酶 K、蛋白沉淀液和酒精，提取基因组 DNA（Cheng et al., 2014）。接着利用 Roche 高保真 PCR 扩增体系（Roche, Indianapolis, IN）扩增提取的基因组 DNA 中的 cfGnRH 序列片段。突变结果同样是使用 Surveyor Mutation Detection 试剂盒（Integrated DNATechnologies, Coralville, IA）进行检测（Qin et al., 2016）。3.2 实验结果3.2.1 高保真 PCR 和 Surveyor CEL-I 突变存在检测实验利用高保真 PCR 技术成功扩增出靶向部分 cfGnRH 基因的序列片段，其中包括外显子 2、3 和 4，大小为 550bp（图 3-1）。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 - m
3.3 讨论高保真 PCR 体系是 Taq 聚合酶和缺少聚合酶活性的热稳定校正蛋白的混合体。它能够以极高的精确性扩增出达到 5000bp 大小的 DNA 片段。本研究需要检测 DNA 序列的突变情况，因此需要利用高保真 PCR 体系，以尽可能地避免扩增过程中可能出现的碱基错配所带来的突变。CELL-I 突变检测技术以及测序结果显示，TALEN 技术已经成功引起靶位点图 3-3 斑点叉尾鮰的测序结果野生型斑点叉尾鮰的测序结果在第一行中列出。标有下划线的序列代表 TALEN 结合部位；红色字母／破折号代表 cfGnRH 部位的修饰过的脱氧核糖核苷酸。Fig. 3-3 Sequences results of channel catfishThe wild-type (wt) channel catfish cfGnRH gene sequence is shown at the first line. Sequencesunderlined are the TALEN binding sites; red letters/dashes indicate the modified nucleotides ofcfGnRH gene.
本文编号：3044606
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