鲤鱼基质金属蛋白酶-2的基因克

发布时间：2021-03-01 23:04

　　基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）是能够降解细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的最重要的金属离子依赖性蛋白酶。MMPs参与许多生理、病理过程，广泛存在于动、植物和微生物体内。研究发现，MMPs参与鱼死后肌肉软化过程中细胞外基质的降解，而胶原酶和明胶酶在此过程中起到关键作用。作为一种重要的蛋白酶，基质金属蛋白酶-2（MMP-2）参与动物胶原蛋白的新陈代谢，但其在水产动物中的存在情况少有报道。本文以淡水鲤鱼为研究对象，克隆得到MMP-2基因序列并利用原核表达系统实现MMP-2催化结构域的体外表达并对重组MMP-2的酶学性质进行深入分析。本研究首先利用RT-PCR和RACE技术从鲤鱼肌肉中克隆得到MMP-2的cDNA全长共2789bp，开放阅读框共1971bp，编码657个氨基酸残基。鲤鱼MMP-2含有四个保守的结构域，包括N端含29个氨基酸残基的信号肽、前肽结构域、含有三个重复Ⅱ型纤连蛋白结构域的催化结构域以及C端的类血红素结构域。利用空间预测软件Swiss-model，对鲤鱼MMP-2进行同源建模，预测其三级结构... 

【文章来源】：集美大学福建省

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 基质金属蛋白酶简介
        1.1.1 MMPs 家族特征
        1.1.2 MMPs 的分类
        1.1.3 MMPs 的空间结构
        1.1.4 MMPs 的活性调节
        1.1.5 MMPs 的内源性抑制剂
    1.2 MMPs 在水产品中的研究现状
    1.3 MMP-2 的研究
    1.4 本研究的目的和意义
第2章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 动物
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂与材料
        2.1.4 常用溶液及培养基配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 基质金属蛋白酶-2 的基因克隆
        2.2.2 生物信息学分析
        2.2.3 重组蛋白的表达与纯化
        2.2.4 重组蛋白的性质分析方法
        2.2.5 多克隆抗体的制备
第3章 结果与分析
    3.1 鲤鱼基质金属蛋白酶-2 的基因克隆
    3.2 鲤鱼 MMP-2 的序列分析
        3.2.1 鲤鱼 MMP-2 一级结构分析
        3.2.2 鲤鱼 MMP-2 的二级结构分析
        3.2.3 鲤鱼 MMP-2 的三级结构分析
    3.3 鲤鱼 MMP-2 催化结构域蛋白的原核表达
        3.3.1 表达质粒的构建
        3.3.2 重组 MMP-2 蛋白的表达与鉴定
        3.3.3 重组 MMP-2 蛋白的纯化及活性验证
    3.4 重组 MMP-2 的性质分析
        3.4.1 重组 MMP-2 最适反应温度和最适 pH
        3.4.2 不同蛋白酶抑制剂对重组 MMP-2 活性的影响
        3.4.3 不同金属离子对重组 MMP-2 活性的影响
    3.5 重组 MMP-2 的降解作用
        3.5.1 重组 MMP-2 对Ⅰ型胶原蛋白的降解作用
        3.5.2 重组 MMP-2 对肌原纤维蛋白的降解作用
        3.5.3 重组 MMP-2 对胶原肽的降解作用
    3.6 鲤鱼肌肉中天然 MMP-2 的检测
    3.7 Ⅱ型纤连蛋白结构域对重组 MMP-2 活性的影响
        3.7.1 Ⅱ型纤连蛋白结构域基因扩增
        3.7.2 重组 Fnt 和△Fnt 表达质粒构建
        3.7.3 重组△Fnt 和 Fnt 蛋白的表达与鉴定
        3.7.4 重组△Fnt 和 Fnt 蛋白的纯化与活性验证
第4章 讨论
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
致谢
参考文献
在学期间发表的学术论文



本文编号：3058152