罗非鱼无乳链球菌快速检测方法的建立及链球菌病的免疫防治技术研究
发布时间：2021-03-23 20:08
罗非鱼是海南等我国南方地区重要的淡水养殖鱼类,但随着其养殖发展,病害的影响越来越严重,其中,细菌性疾病是罗非鱼养殖中最常见和危害最大的疾病,目前常见的细菌性病原包括荧光假单胞菌（Pseudcmonas fluoroscercs）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、海豚链球菌（Streptococcus iniae）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）。在罗非鱼疾病的防治方面,虽然抗生素类药物具有一定的效果,但存在耐药性、药物残留以及污染环境等缺陷,迫切需要探索安全高效的防治措施以促进罗非鱼养殖产业的可持续健康发展。为了快速准确检测养殖罗非鱼细菌性病原,本文采用分子生物学方法建立了上述罗非鱼无乳链球菌的PCR快速鉴定方法,并利用16SrDNA序列对分离筛选获得的无乳链球菌进行分型。为了探索罗非鱼链球菌病的安全高效控制措施,本文以海南当地分离的罗非鱼无乳链球菌强毒株制备了灭活疫苗,利用分光光度计建立了疫苗浓度的快速测定方法,比较研究了高渗浸泡等多种不同免疫接种方法及其免疫效果,建立了...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 罗非鱼链球菌病及水产免疫防治研究进展（综述）
1. 罗非鱼养殖概况
2. 罗非鱼乳链球菌病
2.1 罗非鱼无乳链球菌的生理生化特征
2.2 罗非鱼无乳链球菌流行病学
2.3 罗非鱼无乳链球菌病的临床症状及致病机理
3. 罗非鱼无乳链球菌的鉴定
3.1 常规方法
3.2 细菌自动鉴定仪器鉴定
3.3 分子生物学方法
4. 鱼类疫苗研究进展
4.1 鱼类疫苗的种类
4.2 疫苗免疫途径
4.2.1 注射
4.2.2 口服免疫
4.2.3 浸泡免疫
5. 本研究的主要目的与意义
第二章 罗非鱼无乳链球菌快速鉴定方法的建立
1. 实验材料与仪器
1.1 实验材料
1.2 主要仪器设备
1.3 主要实验试剂
2. 实验方法
2.1 病原菌的活化与扩大培养
2.2 细菌浓度的调整
2.3 引物设计与合成
2.4 PCR反应的优化及特异性检验
2.4.1 PCR反应程序的优化
2.4.2 方法的特异性检验
2.4.3 方法的敏感性检验
3. 实验结果
3.1 PCR反应程序的优化及特异性验证
3.1.1 PCR检测无乳链球菌反应程序优化
3.1.2 特异性检验结果
3.2 方法灵敏度检验
4. 讨论
第三章 无乳链球菌灭活疫苗的制备及免疫保护效果研究
第一节 无乳链球菌灭活疫苗制备及其浓度快速测定方法的建立
1. 实验材料与仪器
1.1 实验材料
1.2 主要仪器
1.3 主要试剂
2. 实验方法
2.1 无乳链球菌致病性确定
2.2 无乳链球菌16S rRNA分子分型
2.3 无乳链球菌灭活疫苗的制备及计数
2.4 无乳链球菌灭活疫苗安全性及有效性检测
2.5 无乳链球菌灭活疫苗浓度检测分光光度法的建立
2.5.1 特异性测定波长的确定
2.5.2 疫苗浓度与吸光值的相关性测定
2.5.3 疫苗浓度稳定性检测
2.5.4 方法重复稳定性检测
3. 实验结果
3.1 病原菌致病性检测结果
3.2 无乳链球菌16S rRNA进化树的建立
3.3 疫苗制备及其安全性检测结果
3.4 疫苗的有效性检测结果
3.5 无乳链球菌疫苗浓度检测波长的选择
600值的相关性"> 3.6 无乳链球菌灭活疫苗浓度与A600值的相关性
3.7 疫苗浓度的稳定性检测
3.8 方法的重复性检测结果
4. 讨论
第二节 无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护效果研究
1. 实验材料与仪器
1.1 实验材料
1.2 实验仪器
1.3 实验试剂
2. 实验方法
2.1 罗非鱼养殖方法
2.2 罗非鱼对高渗溶液的耐受性研究
2.3 不同免疫方法对50日龄罗非鱼免疫效果的影响
2.3.1 免疫相对保护率（RPS）的测定
2.3.2 血清制备
2.3.3 血清抗体效价测定
2.3.4 血清总蛋白测定
2.3.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
2.3.6 溶菌酶含量测定
2.3.7 碱性磷酸酶（AKP）活性测定
2.4 不同日龄罗非鱼免疫效果研究
2.4.1 不同日龄罗非鱼免疫实验
2.4.2 保护率测定
2.4.3 免疫对罗非鱼商品性能影响的测定
3. 结果
3.1 罗非鱼高渗溶液耐受实验
3.2 不同免疫方法对罗非鱼的保护率
3.2.1 不同方法接种罗非鱼无乳链球菌疫苗的抗体效价测定
3.2.2 血清总蛋白测定结果
3.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定结果
3.2.4 溶菌酶含量测定结果
3.2.5 碱性磷酸酶（AKP）活性测定结果
3.3 不同日龄罗非鱼免疫效果
3.3.1 浸泡免疫不同日龄罗非鱼保护率
3.3.2 高渗浸泡二次免疫对不同日龄罗非鱼生长性能的影响
4. 讨论
结论
参考文献
作者在读期间论文发表情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]广东、海南、福建3省罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析[J]. 李莉萍,王瑞,黄婷,甘西,李健,黄维义,黄彦,雷爱莹,陈明,梁万文. 西南农业学报. 2013(05)
[2]2012年广东罗非鱼产业发展形势与对策建议[J]. 雷光英,曹俊明,王玉梅,万忠,李思发. 广东农业科学. 2013(14)
[3]罗非鱼无乳链球菌鉴定及基于cfb和16S rRNA基因同源性分析[J]. 可小丽,卢迈新,李庆勇,霍欢欢,高风英,朱华平. 中国农学通报. 2013(20)
[4]2012年中国罗非鱼产品出口贸易分析及展望[J]. 代云云,袁永明,张红燕,贺艳辉. 中国渔业经济. 2013(02)
[5]人工放流4龄中华鲟盐度适应过程中血清生化指标的变化[J]. 杨吉平,陈立侨,刘健,李二超,郑跃平,崔超,陈锦辉. 大连海洋大学学报. 2013(01)
[6]盐度胁迫对尼罗罗非鱼鳃氯细胞调节变化的影响[J]. 庄青青,赵金良,赵丽慧,苌建菊. 生态学杂志. 2012(10)
[7]盐度对澳洲宝石鲈幼鱼3个免疫因子活力的影响[J]. 张龙岗,安丽,孙栋,董学飒,付佩胜. 水生态学杂志. 2011(06)
[8]食品中荧光假单胞菌聚合酶链式反应检测体系的建立和评价[J]. 杨一林,周敏,施春雷,杨捷琳,史贤明. 食品科学. 2011(20)
[9]罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立[J]. 王均,汪开毓,肖丹,黄锦炉,付希,王浩丞,陈德芳,耿毅,阳涛. 中国兽医科学. 2011(05)
[10]罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因的克隆和分子特性分析[J]. 汪开毓,付希,肖丹,黄锦炉,王均,王浩丞. 水产学报. 2011(05)
硕士论文
[1]无乳链球菌、海豚链球菌及荧光假单胞菌多重PCR检测方法的建立和应用[D]. 刘贝贝.四川农业大学 2013
[2]海南罗非鱼链球菌病病原分离鉴定及防治中草药筛选[D]. 邓恒为.海南大学 2013
[3]罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究[D]. 李庆勇.上海海洋大学 2013
[4]罗非鱼海豚链球菌疫苗的研制及免疫效果的初步研究[D]. 徐增辉.广西大学 2008
[5]分枝杆菌种间及种内不同株之间16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析[D]. 闫李侠.兰州大学 2008
[6]嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌多重PCR检测方法的建立与应用[D]. 饶静静.南京农业大学 2007
本文编号：3096352
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 罗非鱼链球菌病及水产免疫防治研究进展（综述）
1. 罗非鱼养殖概况
2. 罗非鱼乳链球菌病
2.1 罗非鱼无乳链球菌的生理生化特征
2.2 罗非鱼无乳链球菌流行病学
2.3 罗非鱼无乳链球菌病的临床症状及致病机理
3. 罗非鱼无乳链球菌的鉴定
3.1 常规方法
3.2 细菌自动鉴定仪器鉴定
3.3 分子生物学方法
4. 鱼类疫苗研究进展
4.1 鱼类疫苗的种类
4.2 疫苗免疫途径
4.2.1 注射
4.2.2 口服免疫
4.2.3 浸泡免疫
5. 本研究的主要目的与意义
第二章 罗非鱼无乳链球菌快速鉴定方法的建立
1. 实验材料与仪器
1.1 实验材料
1.2 主要仪器设备
1.3 主要实验试剂
2. 实验方法
2.1 病原菌的活化与扩大培养
2.2 细菌浓度的调整
2.3 引物设计与合成
2.4 PCR反应的优化及特异性检验
2.4.1 PCR反应程序的优化
2.4.2 方法的特异性检验
2.4.3 方法的敏感性检验
3. 实验结果
3.1 PCR反应程序的优化及特异性验证
3.1.1 PCR检测无乳链球菌反应程序优化
3.1.2 特异性检验结果
3.2 方法灵敏度检验
4. 讨论
第三章 无乳链球菌灭活疫苗的制备及免疫保护效果研究
第一节 无乳链球菌灭活疫苗制备及其浓度快速测定方法的建立
1. 实验材料与仪器
1.1 实验材料
1.2 主要仪器
1.3 主要试剂
2. 实验方法
2.1 无乳链球菌致病性确定
2.2 无乳链球菌16S rRNA分子分型
2.3 无乳链球菌灭活疫苗的制备及计数
2.4 无乳链球菌灭活疫苗安全性及有效性检测
2.5 无乳链球菌灭活疫苗浓度检测分光光度法的建立
2.5.1 特异性测定波长的确定
2.5.2 疫苗浓度与吸光值的相关性测定
2.5.3 疫苗浓度稳定性检测
2.5.4 方法重复稳定性检测
3. 实验结果
3.1 病原菌致病性检测结果
3.2 无乳链球菌16S rRNA进化树的建立
3.3 疫苗制备及其安全性检测结果
3.4 疫苗的有效性检测结果
3.5 无乳链球菌疫苗浓度检测波长的选择
600值的相关性"> 3.6 无乳链球菌灭活疫苗浓度与A600值的相关性
3.7 疫苗浓度的稳定性检测
3.8 方法的重复性检测结果
4. 讨论
第二节 无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼链球菌病的免疫保护效果研究
1. 实验材料与仪器
1.1 实验材料
1.2 实验仪器
1.3 实验试剂
2. 实验方法
2.1 罗非鱼养殖方法
2.2 罗非鱼对高渗溶液的耐受性研究
2.3 不同免疫方法对50日龄罗非鱼免疫效果的影响
2.3.1 免疫相对保护率（RPS）的测定
2.3.2 血清制备
2.3.3 血清抗体效价测定
2.3.4 血清总蛋白测定
2.3.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
2.3.6 溶菌酶含量测定
2.3.7 碱性磷酸酶（AKP）活性测定
2.4 不同日龄罗非鱼免疫效果研究
2.4.1 不同日龄罗非鱼免疫实验
2.4.2 保护率测定
2.4.3 免疫对罗非鱼商品性能影响的测定
3. 结果
3.1 罗非鱼高渗溶液耐受实验
3.2 不同免疫方法对罗非鱼的保护率
3.2.1 不同方法接种罗非鱼无乳链球菌疫苗的抗体效价测定
3.2.2 血清总蛋白测定结果
3.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定结果
3.2.4 溶菌酶含量测定结果
3.2.5 碱性磷酸酶（AKP）活性测定结果
3.3 不同日龄罗非鱼免疫效果
3.3.1 浸泡免疫不同日龄罗非鱼保护率
3.3.2 高渗浸泡二次免疫对不同日龄罗非鱼生长性能的影响
4. 讨论
结论
参考文献
作者在读期间论文发表情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]广东、海南、福建3省罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析[J]. 李莉萍,王瑞,黄婷,甘西,李健,黄维义,黄彦,雷爱莹,陈明,梁万文. 西南农业学报. 2013(05)
[2]2012年广东罗非鱼产业发展形势与对策建议[J]. 雷光英,曹俊明,王玉梅,万忠,李思发. 广东农业科学. 2013(14)
[3]罗非鱼无乳链球菌鉴定及基于cfb和16S rRNA基因同源性分析[J]. 可小丽,卢迈新,李庆勇,霍欢欢,高风英,朱华平. 中国农学通报. 2013(20)
[4]2012年中国罗非鱼产品出口贸易分析及展望[J]. 代云云,袁永明,张红燕,贺艳辉. 中国渔业经济. 2013(02)
[5]人工放流4龄中华鲟盐度适应过程中血清生化指标的变化[J]. 杨吉平,陈立侨,刘健,李二超,郑跃平,崔超,陈锦辉. 大连海洋大学学报. 2013(01)
[6]盐度胁迫对尼罗罗非鱼鳃氯细胞调节变化的影响[J]. 庄青青,赵金良,赵丽慧,苌建菊. 生态学杂志. 2012(10)
[7]盐度对澳洲宝石鲈幼鱼3个免疫因子活力的影响[J]. 张龙岗,安丽,孙栋,董学飒,付佩胜. 水生态学杂志. 2011(06)
[8]食品中荧光假单胞菌聚合酶链式反应检测体系的建立和评价[J]. 杨一林,周敏,施春雷,杨捷琳,史贤明. 食品科学. 2011(20)
[9]罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立[J]. 王均,汪开毓,肖丹,黄锦炉,付希,王浩丞,陈德芳,耿毅,阳涛. 中国兽医科学. 2011(05)
[10]罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因的克隆和分子特性分析[J]. 汪开毓,付希,肖丹,黄锦炉,王均,王浩丞. 水产学报. 2011(05)
硕士论文
[1]无乳链球菌、海豚链球菌及荧光假单胞菌多重PCR检测方法的建立和应用[D]. 刘贝贝.四川农业大学 2013
[2]海南罗非鱼链球菌病病原分离鉴定及防治中草药筛选[D]. 邓恒为.海南大学 2013
[3]罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究[D]. 李庆勇.上海海洋大学 2013
[4]罗非鱼海豚链球菌疫苗的研制及免疫效果的初步研究[D]. 徐增辉.广西大学 2008
[5]分枝杆菌种间及种内不同株之间16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析[D]. 闫李侠.兰州大学 2008
[6]嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌多重PCR检测方法的建立与应用[D]. 饶静静.南京农业大学 2007
本文编号：3096352
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