南方鲇爱德华氏菌的分离鉴定及双重PCR诊断方法的建立

发布时间：2021-04-06 00:30

　　本研究采集发病南方鲇进行了迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的分离鉴定,并对迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的双重PCR诊断方法进行构建。从乐山南方鲇养殖场采集自然发病南方鲇,无菌操作从病鱼肝、肾分离优势菌,结果从自然发病鱼肝、肾中分离到两株优势菌（CH0406和H0701）。人工感染试验确定其病原性,人工感染试验结果证实两分离株为南方鲇的致病菌,人工感染鱼出现与自然感染相似的临床症状与病变；对分离菌株进行各项理化性质测定发现,分离株CH0406在LB平板上28℃培养24h就能长出形成边缘整齐,灰白色,直径为0.5-1mm的圆形菌落,H0701在BHI培养基上28℃培养48h形成直径0.2-0.3mm针尖大小,表面光滑,边缘整齐,无色透明的圆形菌落的菌落；分离株CH0406和H0701生化特性分别与E. tarda标准菌株（ATCC15947）和E.ictaluri标准菌株（ATCC33202）一致；采用细菌16S rDNA保守区通用引物（F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, R:5’-TACGGCTACCT TGTTACGAC-3’）进行基因扩增,扩增出预期大小的约150... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 南方鲇的生物学特性
    2 南方鲇常见疾病
        2.1 细菌性疾病
        2.2 真菌性疾病
        2.3 寄生虫疾病
        2.4 其它因素引起的疾病
    3 迟缓爱德华氏菌的研究进展
        3.1 迟缓爱德华氏菌的分类地位
        3.2 迟缓爱德华氏菌的生物学特性
            3.2.1 培养特性
            3.2.2 生化特性
            3.2.3 血清型
        3.3 迟缓爱德华氏菌的流行病学
            3.3.1 感染范围
            3.3.2 感染症状
        3.4 迟缓爱德华氏菌检测技术的研究进展
        3.5 迟缓爱德华氏菌病的防治
    4 鮰爱德华氏菌的研究进展
        4.1 鮰爱德华氏菌的分类地位
        4.2 鮰爱德华氏菌生物学特性
            4.2.1 培养特性
            4.2.2 生化特性
            4.2.3 血清型
        4.3 鮰爱德华氏菌的流行病学
            4.3.1 感染范围
            4.3.2 感染症状
        4.4 鮰爱德华氏菌检测技术的研究进展
        4.5 鮰爱德华氏菌病的防治
    5 双重PCR技术概述
    6 研究的目的与意义
第二章 南方鲇爱德华氏菌的分离鉴定
    1 材料
        1.1 实验动物
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
    2 实验方法
        2.1 病鱼的采集
        2.2 病原菌的分离与纯化
        2.3 人工感染试验
        2.4 表型特征检测
            2.4.1 培养特性检测
            2.4.2 生化特性检测
        2.5 16S rDNA序列测定与系统发育分析
        2.6 gadB与eip基因序列测定和分析
    3 结果
        3.1 病原菌的分离
        3.2 人工感染试验
        3.3 表型特征检测
            3.3.1 培养特性检测
            3.3.2 生化特性
        3.4 16S rDNA序列测定与系统发育分析
        3.5 gadB与eip基因序列测定和分析
    4 讨论
        4.1 爱德华氏菌的危害
        4.2 爱德华氏菌培养特性
        4.3 爱德华氏菌病的防治
        4.4 爱德华氏菌的鉴定
第三章 迟缓爱德华氏菌与鮰爱德华氏菌双重PCR方法的建立
    1 材料
        1.1 菌株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 双重PCR引物的合成
        2.2 E.tarda DNA的提取
        2.3 E.ictaluri DNA的提取
        2.4 E.tarda单一PCR和Eictaluri单一PCR的优化
        2.5 双重PCR条件的优化
            2.5.1 退火温度的优化
2+浓度的优化">            2.5.2 Mg²⁺浓度的优化
            2.5.3 引物浓度的优化
            2.5.4 模板DNA质量浓度的优化
        2.6 PCR产物检测
        2.7 双重PCR与单一PCR的比较
            2.7.1 特异性的比较
            2.7.2 灵敏性的比较
    3 结果
        3.1 迟缓爱德华氏菌单一PCR条件优化结果
        3.2 鮰爱德华氏菌单一PCR条件优化结果
        3.3 双重PCR条件优化结果
        3.4 特异性比较结果
            3.4.1 迟缓爱德华氏菌PCR的特异性实验
            3.4.2 鮰爱德华氏菌PCR的特异性实验
            3.4.3 双重PCR的特异性实验
        3.5 敏感性比较结果
            3.5.1 迟缓爱德华氏菌PCR的敏感性实验结果
            3.5.2 鮰爱德华氏菌PCR的敏感性实验结果
            3.5.3 双重PCR的敏感性实验结果
    4 讨论
        4.1 双重PCR方法的优点
        4.2 双重PCR引物的设计
        4.3 双重PCR的条件优化
        4.4 双重PCR方法的敏感性
结论
参考文献
致谢



本文编号：3120398