SVCV感染EPC细胞诱导细胞自噬的分子机制及蛋白质组学研究
发布时间：2021-04-22 23:24
鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of Carp Virus, SVCV）可感染多种鲤科鱼类,引起出血和腹腔炎等症状,造成巨大的经济损失,但SVCV感染宿主的致病机理目前知之甚少。细胞自噬（Autophagy）是真核细胞包裹胞内需要降解成分运输至溶酶体并降解以维持自身健康的过程。自噬在抗病原微生物感染等过程中有重要作用,但病毒也可通过其自身编码的蛋白抑制细胞自噬,逃避自噬的清除作用。本研究围绕SVCV感染与细胞自噬的关系及利用蛋白质组学分析SVCV感染宿主细胞后差异性蛋白,以期为解析SVCV的致病机制提供科学依据。主要内容如下：1. SVCV感染EPC细胞诱导细胞自噬的分子机制通过电镜,激光共聚焦显微镜和免疫印迹方法观察,发现SVCV感染鲤上皮瘤细胞（EPC）后可以诱导细胞自噬,进一步研究发现SVCV的糖蛋白（G）在诱导细胞自噬中发挥重要作用。在此基础上,通过荧光定量PCR,免疫印迹和病毒滴度测定分析抑制或激活细胞自噬后病毒滴度和mRNA的变化,我们发现自噬对SVCV的复制及病毒粒子的释放具有促进作用,且该作用是通过及时清除受损的线粒体延长细胞存活时间实现的。进一步分析发...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 鲤春病毒血症病毒研究进展
1.1.1 SVC流行特点
1.1.2 SVCV生物学特性
1.1.3 SVCV基因组结构
1.1.4 SVCV的结构蛋白
1.1.4.1 核蛋白
1.1.4.2 基质蛋白
1.1.4.3 糖蛋白
1.1.4.4 磷蛋白
1.1.4.5 病毒依赖性RNA聚合酶蛋白
1.2 细胞自噬研究概论
1.2.1 细胞自噬的种类及过程
1.2.2 细胞自噬的分子机理
1.2.3 细胞自噬的信号通路调节
1.2.4 细胞自噬的常用研究方法
1.2.4.1 扫描透射电镜观察
1.2.4.2 免疫荧光技术
1.2.4.3 Western blot检测细胞自噬标记蛋白LC3的表型变化
1.2.4.4 长寿蛋白的降解
1.2.4.5 p62的降解
1.2.5 细胞自噬与病毒感染的研究进展
1.2.6 细胞自噬与机体免疫研究进展
1.3 蛋白质组学方法及研究现状
2 研究目的及意义
3 SVCV诱导细胞自噬的发生和分子机理
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 细胞、毒株
3.2.2 载体与质粒
3.2.3 引物序列及siRNA
3.2.4 主要试剂
3.2.5 培养基与抗生素及其配制
3.2.6 主要实验仪器及设备
3.2.7 分子生物学分析软件
3.3 实验方法
3.3.1 表达质粒的构建
3.3.2 Western blot实验
3.3.2.1 样品制备
3.3.2.2 SDS-PAGE电泳
3.3.2.3 Western Blot检测分析
3.3.3 siRNA及质粒转染
3.3.4 间接免疫荧光实验
3.3.5 激光共聚焦显微镜观测
3.3.6 MTT法检测细胞活性
3.3.7 透射电镜观察
3.3.8 荧光定量PCR分析
3.3.9 细胞培养与病毒滴度测定
3.3.10 紫外灭活病毒的制备
3.3.11 统计学方法
3.4 实验结果
3.4.1 SVCV感染EPC细胞诱导细胞自噬
3.4.1.1 EGFP-LC3融合表达质粒的构建
3.4.1.2 扫描透射电镜观察SVCV感染细胞后形成自噬泡结构
3.4.1.3 SVCV感染EPC细胞有自噬小体的点状聚集
3.4.1.4 SVCV感染EPC细胞后LC3的表达变化
3.4.2 细胞自噬促进SVCV的增殖
3.4.2.1. 自噬抑制剂和自噬诱导剂对细胞毒性的影响
3.4.2.2 细胞自噬对SVCV mRNA复制的影响
3.4.2.3 细胞自噬对SVCV粒子释放的影响
3.4.2.4 干扰LC3和Beclin-1基因表达抑制SVCV复制和释放
3.4.2.5 细胞自噬对SVCV入侵的作用
3.4.3 SVCV诱导EPC细胞自噬机理的探讨
3.4.3.1 SVCV入侵可以诱导细胞自噬
3.4.3.2 SVCV/G可以诱导细胞自噬
3.4.3.3 mTOR蛋白在SVCV诱导细胞自噬中的作用
3.4.3.4 ERK蛋白在SVCV诱导细胞自噬中的作用
3.4.3.5 SVCV通过激活ERK蛋白抑制mTOR蛋白诱导细胞自噬
3.4.4 细胞自噬促进病毒复制机理的初步探讨
3.4.4.1 细胞自噬通过延长被感染细胞的存活时间促进病毒复制
3.4.4.2 细胞自噬可以清除细胞内受损的线粒体
3.5 讨论与结论
3.5.1 讨论
3.5.1.1 SVCV感染宿主细胞产生完全细胞自噬
3.5.1.2 细胞自噬促进SVCV的增殖
3.5.1.3 mTOR-RK途径参与SVCV诱导细胞自噬进程
3.5.2 结论
4 SVCV感染宿主细胞的蛋白质组学分析
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 细胞、毒株
4.2.2 主要试剂
4.2.3 实验仪器
4.2.4 生物信息学分析软件
4.3 实验方法
4.3.1 细胞总蛋白质的制备
4.3.2 双向凝胶电泳
4.3.2.1 第一向固相pH梯度等电聚焦
4.3.2.2 第二向SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳
4.3.2.3 凝胶染色
4.3.2.4 双向凝胶电泳图像扫描及图像分析
4.3.3 制备质谱样品
4.3.4 MALDI-TOF-MS质谱分析及质谱数据的数据库搜寻
4.3.5 差异蛋白质的生物信息学分析
4.3.6 Western blot分析
4.3.7 实时荧光定量分析
4.4 实验结果
4.4.1 双向电泳和质谱鉴定的差异蛋白分析
4.4.2 实时荧光定量PCR验证SVCV感染的差异性蛋白
4.4.3 Western blot验证SVCV感染的差异性蛋白
4.5 讨论与结论
4.5.1 SVCV感染导致细胞骨架相关蛋白的改变
4.5.2 SVCV感染导致泛素蛋白酶体途径（UPP）相关蛋白的改变
4.5.3 SVCV感染导致信号通路相关蛋白的改变
4.5.4 SVCV感染导致生物代谢相关蛋白的改变
参考文献
附录
致谢
本文编号：3154642
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 鲤春病毒血症病毒研究进展
1.1.1 SVC流行特点
1.1.2 SVCV生物学特性
1.1.3 SVCV基因组结构
1.1.4 SVCV的结构蛋白
1.1.4.1 核蛋白
1.1.4.2 基质蛋白
1.1.4.3 糖蛋白
1.1.4.4 磷蛋白
1.1.4.5 病毒依赖性RNA聚合酶蛋白
1.2 细胞自噬研究概论
1.2.1 细胞自噬的种类及过程
1.2.2 细胞自噬的分子机理
1.2.3 细胞自噬的信号通路调节
1.2.4 细胞自噬的常用研究方法
1.2.4.1 扫描透射电镜观察
1.2.4.2 免疫荧光技术
1.2.4.3 Western blot检测细胞自噬标记蛋白LC3的表型变化
1.2.4.4 长寿蛋白的降解
1.2.4.5 p62的降解
1.2.5 细胞自噬与病毒感染的研究进展
1.2.6 细胞自噬与机体免疫研究进展
1.3 蛋白质组学方法及研究现状
2 研究目的及意义
3 SVCV诱导细胞自噬的发生和分子机理
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 细胞、毒株
3.2.2 载体与质粒
3.2.3 引物序列及siRNA
3.2.4 主要试剂
3.2.5 培养基与抗生素及其配制
3.2.6 主要实验仪器及设备
3.2.7 分子生物学分析软件
3.3 实验方法
3.3.1 表达质粒的构建
3.3.2 Western blot实验
3.3.2.1 样品制备
3.3.2.2 SDS-PAGE电泳
3.3.2.3 Western Blot检测分析
3.3.3 siRNA及质粒转染
3.3.4 间接免疫荧光实验
3.3.5 激光共聚焦显微镜观测
3.3.6 MTT法检测细胞活性
3.3.7 透射电镜观察
3.3.8 荧光定量PCR分析
3.3.9 细胞培养与病毒滴度测定
3.3.10 紫外灭活病毒的制备
3.3.11 统计学方法
3.4 实验结果
3.4.1 SVCV感染EPC细胞诱导细胞自噬
3.4.1.1 EGFP-LC3融合表达质粒的构建
3.4.1.2 扫描透射电镜观察SVCV感染细胞后形成自噬泡结构
3.4.1.3 SVCV感染EPC细胞有自噬小体的点状聚集
3.4.1.4 SVCV感染EPC细胞后LC3的表达变化
3.4.2 细胞自噬促进SVCV的增殖
3.4.2.1. 自噬抑制剂和自噬诱导剂对细胞毒性的影响
3.4.2.2 细胞自噬对SVCV mRNA复制的影响
3.4.2.3 细胞自噬对SVCV粒子释放的影响
3.4.2.4 干扰LC3和Beclin-1基因表达抑制SVCV复制和释放
3.4.2.5 细胞自噬对SVCV入侵的作用
3.4.3 SVCV诱导EPC细胞自噬机理的探讨
3.4.3.1 SVCV入侵可以诱导细胞自噬
3.4.3.2 SVCV/G可以诱导细胞自噬
3.4.3.3 mTOR蛋白在SVCV诱导细胞自噬中的作用
3.4.3.4 ERK蛋白在SVCV诱导细胞自噬中的作用
3.4.3.5 SVCV通过激活ERK蛋白抑制mTOR蛋白诱导细胞自噬
3.4.4 细胞自噬促进病毒复制机理的初步探讨
3.4.4.1 细胞自噬通过延长被感染细胞的存活时间促进病毒复制
3.4.4.2 细胞自噬可以清除细胞内受损的线粒体
3.5 讨论与结论
3.5.1 讨论
3.5.1.1 SVCV感染宿主细胞产生完全细胞自噬
3.5.1.2 细胞自噬促进SVCV的增殖
3.5.1.3 mTOR-RK途径参与SVCV诱导细胞自噬进程
3.5.2 结论
4 SVCV感染宿主细胞的蛋白质组学分析
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 细胞、毒株
4.2.2 主要试剂
4.2.3 实验仪器
4.2.4 生物信息学分析软件
4.3 实验方法
4.3.1 细胞总蛋白质的制备
4.3.2 双向凝胶电泳
4.3.2.1 第一向固相pH梯度等电聚焦
4.3.2.2 第二向SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳
4.3.2.3 凝胶染色
4.3.2.4 双向凝胶电泳图像扫描及图像分析
4.3.3 制备质谱样品
4.3.4 MALDI-TOF-MS质谱分析及质谱数据的数据库搜寻
4.3.5 差异蛋白质的生物信息学分析
4.3.6 Western blot分析
4.3.7 实时荧光定量分析
4.4 实验结果
4.4.1 双向电泳和质谱鉴定的差异蛋白分析
4.4.2 实时荧光定量PCR验证SVCV感染的差异性蛋白
4.4.3 Western blot验证SVCV感染的差异性蛋白
4.5 讨论与结论
4.5.1 SVCV感染导致细胞骨架相关蛋白的改变
4.5.2 SVCV感染导致泛素蛋白酶体途径（UPP）相关蛋白的改变
4.5.3 SVCV感染导致信号通路相关蛋白的改变
4.5.4 SVCV感染导致生物代谢相关蛋白的改变
参考文献
附录
致谢
本文编号：3154642
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3154642.html
