鮰爱德华氏菌ompN基因的克隆及其原核表达产物对斑点叉尾鮰的保护效果评价
发布时间：2021-04-27 22:57
本实验以鮰爱德华氏菌（Edwarsiella ictaluri）GPY株的基因组DNA为模板,克隆出三段外膜微孔蛋白N全基因（Outer membrane protein, OMP）,并应用生物信息学相关软件对其氨基酸序列进行分析。去信号肽和跨膜区后克隆并表达了其对应的三段功能活性区域,并通过免疫印迹确定表达产物具有免疫原性,初步将其确定为亚单位候选疫苗。用表达的rOmpNs作为抗原,免疫健康斑点叉尾鮰,探究其对斑点叉尾钢的免疫保护效果。通过本实验,拟对鮰爱德华氏菌ompNs的生理特性进行初步探讨,并为制备具有保护力的抗鮰爱德华氏菌亚单位疫苗提供理论基础。本研究共分为三个章节,概述如下：1.鮰爱德华氏菌ompN全基因克隆、鉴定和序列特性分析对鮰爱德华氏菌ompNs全基因进行克隆,获得阳性克隆质粒pMD19-T-omp N1、pMD19-T-ompN2和pMD19-T-ompN3。利用生物信息学相关软件分别对opmN1、ompN2和ompN3编码的氨基酸序列进行分析。结果显示鮰爱德华氏菌GPY菌株的ompNs基因编码的氨基酸序列均含有一个外膜通道蛋白（OMchann...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
1. 鮰爱德华氏菌及生物学特性
1.1 鮰爱德华氏菌的发现及分类
1.2 鮰爱德华氏菌的生物学特性
1.3 鮰爱德华氏菌的血清型
2. 鱼类鮰爱德华氏菌病的临床症状和病理变化
2.1 鮰爱德华氏菌的感染宿主
2.2 鮰爱德华氏菌感染的临床症状和病理变化
3. 鮰爱德华氏菌的毒力因子及致病机制
3.1 透明质酸酶
3.2 细胞附属物
3.3 脂多糖
3.4 细胞膜破坏毒素(MDTs)
3.5 外膜蛋白
4. 论文研究的目的意义
第二章 鮰爱德华氏菌ompNs全基因的克隆及生物信息学分析
1. 试验材料
1.1 菌株及载体
1.2 主要仪器设备
1.3 主要试剂
1.4 主要试剂配置
2. 试验方法
2.1 鮰爱德华氏菌ompNs全基因扩增
2.2 ompNs全基因的T-载体克隆与鉴定
2.3 生物信息学分析
3 结果
3.1 ompNs全基因的扩增、T克隆和鉴定
3.2 ompNs全基因的核酸序列理化特性分析
3.4 ompNs全基因编码的氨基酸序列翻译后的修饰位点预测
3.6 ompNs全基因编码的氨基酸序列的B细胞表位预测
3.7 ompNs全基因编码的蛋白的亚细胞定位预测
4. 讨论
4.1 ompNs全基因编码的氨基酸序列特性
4.2 ompNs全基因编码的氨基酸序列B细胞表位分析
第三章 鮰爱德华氏菌ompNs功能活性区域克隆,原核表达及免疫原性分析
1. 试验材料
1.1 质粒、菌株和细胞
1.2 试验动物
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂
1.5 主要溶液及培养基的配置
2 试验方法
2.1 引物设计与合成
2.2 PCR扩增
2.3 纯化PCR产物与pMD19-T连接
2.4 T克隆ompNs基因的鉴定
2.5 表达载体pET-32a(+)-pompN1/pompN2/pompN3的构建和表达
2.6 rOmpN1/rOmpN2/rOmpN3的制备与纯化
2.7 兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体的制备
2.8 兔抗鮰爱德华氏菌的IgG多克隆抗体的纯化
2.9 Western-blotting检测rOmpNs特异性
3. 结果
3.1 斑点叉尾鮰pompN1/pompN2/pompN3截段基因的扩增、T克隆和鉴定
3.2 重组质粒pET-32a(+)-pompN1/pompN2/pompN3诱导表达及纯化
3.3 兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体IgG的制备及效价测定
3.4 Western-blotting检测重组rOmpN1/rOmpN2/rOmpN3的特异性
4 讨论
4.1 表达区段的选择
4.2 表达载体的选择
4.3. 原核表达中包涵体的形成及免疫原性分析
第四章 rOmpNs蛋白对斑点叉尾鮰的免疫效果研究
1. 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 试验动物
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂
2. 试验方法
2.1 抗原制备
2.2 rOmpNs免疫试验
2.3 免疫指标检测
2.4 rOmpNs对斑点叉尾鮰细胞因子转录影响
2.5 统计学分析
3. 试验结果
3.1 斑点叉尾鮰抗OmpNs抗体效价检测
3.2 补体旁路途径溶血活性的测定(ACH50)
3.3 血清溶菌酶活力检测
3.4 血清SOD、AKP、ACP总活性和总蛋白含量测定
3.5 相对免疫保护率
3.7 Real-time PCR分析斑点叉尾鮰相关基因的转录表达情况
4. 讨论
4.1 不同抗原对斑点叉尾鮰血清指标的影响
4.2 不同抗原对斑点叉尾鮰攻毒后死亡率和相对免疫保护率的影响
4.3 不同抗原对斑点叉尾鮰mRNA水平的影响
结论
参考文献
致谢
硕士研究生期间发表论文情况
本文编号：3164295
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
1. 鮰爱德华氏菌及生物学特性
1.1 鮰爱德华氏菌的发现及分类
1.2 鮰爱德华氏菌的生物学特性
1.3 鮰爱德华氏菌的血清型
2. 鱼类鮰爱德华氏菌病的临床症状和病理变化
2.1 鮰爱德华氏菌的感染宿主
2.2 鮰爱德华氏菌感染的临床症状和病理变化
3. 鮰爱德华氏菌的毒力因子及致病机制
3.1 透明质酸酶
3.2 细胞附属物
3.3 脂多糖
3.4 细胞膜破坏毒素(MDTs)
3.5 外膜蛋白
4. 论文研究的目的意义
第二章 鮰爱德华氏菌ompNs全基因的克隆及生物信息学分析
1. 试验材料
1.1 菌株及载体
1.2 主要仪器设备
1.3 主要试剂
1.4 主要试剂配置
2. 试验方法
2.1 鮰爱德华氏菌ompNs全基因扩增
2.2 ompNs全基因的T-载体克隆与鉴定
2.3 生物信息学分析
3 结果
3.1 ompNs全基因的扩增、T克隆和鉴定
3.2 ompNs全基因的核酸序列理化特性分析
3.4 ompNs全基因编码的氨基酸序列翻译后的修饰位点预测
3.6 ompNs全基因编码的氨基酸序列的B细胞表位预测
3.7 ompNs全基因编码的蛋白的亚细胞定位预测
4. 讨论
4.1 ompNs全基因编码的氨基酸序列特性
4.2 ompNs全基因编码的氨基酸序列B细胞表位分析
第三章 鮰爱德华氏菌ompNs功能活性区域克隆,原核表达及免疫原性分析
1. 试验材料
1.1 质粒、菌株和细胞
1.2 试验动物
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂
1.5 主要溶液及培养基的配置
2 试验方法
2.1 引物设计与合成
2.2 PCR扩增
2.3 纯化PCR产物与pMD19-T连接
2.4 T克隆ompNs基因的鉴定
2.5 表达载体pET-32a(+)-pompN1/pompN2/pompN3的构建和表达
2.6 rOmpN1/rOmpN2/rOmpN3的制备与纯化
2.7 兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体的制备
2.8 兔抗鮰爱德华氏菌的IgG多克隆抗体的纯化
2.9 Western-blotting检测rOmpNs特异性
3. 结果
3.1 斑点叉尾鮰pompN1/pompN2/pompN3截段基因的扩增、T克隆和鉴定
3.2 重组质粒pET-32a(+)-pompN1/pompN2/pompN3诱导表达及纯化
3.3 兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体IgG的制备及效价测定
3.4 Western-blotting检测重组rOmpN1/rOmpN2/rOmpN3的特异性
4 讨论
4.1 表达区段的选择
4.2 表达载体的选择
4.3. 原核表达中包涵体的形成及免疫原性分析
第四章 rOmpNs蛋白对斑点叉尾鮰的免疫效果研究
1. 试验材料
1.1 试验菌株
1.2 试验动物
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂
2. 试验方法
2.1 抗原制备
2.2 rOmpNs免疫试验
2.3 免疫指标检测
2.4 rOmpNs对斑点叉尾鮰细胞因子转录影响
2.5 统计学分析
3. 试验结果
3.1 斑点叉尾鮰抗OmpNs抗体效价检测
3.2 补体旁路途径溶血活性的测定(ACH50)
3.3 血清溶菌酶活力检测
3.4 血清SOD、AKP、ACP总活性和总蛋白含量测定
3.5 相对免疫保护率
3.7 Real-time PCR分析斑点叉尾鮰相关基因的转录表达情况
4. 讨论
4.1 不同抗原对斑点叉尾鮰血清指标的影响
4.2 不同抗原对斑点叉尾鮰攻毒后死亡率和相对免疫保护率的影响
4.3 不同抗原对斑点叉尾鮰mRNA水平的影响
结论
参考文献
致谢
硕士研究生期间发表论文情况
本文编号：3164295
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3164295.html
