中华草龟两种细菌病原灭活疫苗研制及罗非鱼细胞培养初探

发布时间：2021-05-12 05:44

　　2018年全国龟类养殖总量47676吨,比2017年增长4.10%;全国淡水养殖鱼类2544万吨,其中罗非鱼养殖产量为162万吨,占比6.4%。近年来,水产养殖行业集约化提高,疫病尤其是细菌性疾病成为制约行业发展的主要问题之一。肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）和迟缓爱德华氏（Edwardsiella tarda）是龟类常见细菌病原。罗非鱼的迟缓爱德华氏菌病和无乳链球菌病是两大暴发性疾病。以上三种细菌均为人畜共患菌,不仅影响养殖业的持续发展,也对人类的生命健康造成威胁。龟鳖疫苗研制相对滞后,龟肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌的疫苗仍处于空白,罗非鱼的无乳链球菌和迟缓爱德华氏菌已有较多学者进行研究,但目前细胞水平的研究相对较少,因此,本文开展了以下工作:1、对发病中华草龟（Chinemys reevesii）分离的S27和S28致病菌通过分离纯化、生长特性鉴定、生化实验、分子生物学实验进行鉴定,并分别测定半数致死量(LD₅₀),选取23种药物对分离菌株进行药敏实验。结果显示,S27和S28分别鉴定为肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌,对中华花龟的半数致... 

【文章来源】：上海海洋大学上海市

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.龟类简介
        1.1 龟的价值
            1.1.1 龟的科学研究价值
            1.1.2 龟的食用价值
            1.1.3 龟的药用价值
            1.1.4 龟的观赏价值
            1.1.5 龟的文化价值
        1.2 龟类常见疾病
            1.2.1 白眼病
            1.2.2 腐皮病
            1.2.3 腐甲病
            1.2.4 水霉病
        1.3 龟养殖现状
    2.肺炎克雷伯菌
        2.1 肺炎克雷伯菌的致病性
        2.2 肺炎克雷伯菌的耐药机制
            2.2.1 膜主动外排系统
            2.2.2 生物被膜保护
            2.2.3 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)
            2.2.4 头孢菌素酶(AmpC)
            2.2.5 碳青霉烯酶
        2.3 肺炎克雷伯菌疫苗
            2.3.1 多糖疫苗
            2.3.2 结合疫苗
            2.3.3 灭活疫苗
            2.3.4 单克隆抗体
    3 迟缓爱德华氏菌
        3.1 迟缓爱德华氏菌致病机理
            3.1.1 黏附与侵入
            3.1.2 抵抗宿主免疫机制
            3.1.3 毒素
        3.2 迟缓爱德华氏菌鉴定
        3.3 迟缓爱德华氏菌防治
            3.3.1 灭活疫苗
            3.3.2 弱毒疫苗
            3.3.3 空壳疫苗
            3.3.4 亚单位疫苗
            3.3.5 DNA疫苗
            3.3.6 外膜小泡疫苗
    4 细胞培养
        4.1 细胞培养方法
            4.1.1 组织块贴壁培养
            4.1.2 解离细胞培养
        4.2 细胞培养条件
            4.2.1 营养物质
            4.2.2 生长因子
            4.2.3 抗生素
            4.2.4 温度
        4.3 细胞应用
    5 免疫因子
        5.1MyD88
        5.2 TNF-ɑ
        5.3 IL-1?
        5.4 NF-κB
    6 研究目的与意义
第二章 病原菌分离及鉴定
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 实验仪器
            1.1.3 实验试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 病原菌的分离
            1.2.2 生化鉴定
            1.2.3 16SrRNA序列测定与分析
            1.2.4 人工回归感染试验
            1.2.5 药敏试验
    2 结果
        2.1 分离菌株的培养特性
        2.2 生化鉴定结果
        2.3 16SrRNA测序结果
        2.4 人工感染试验
        2.5 药敏试验
    3 讨论
第三章 分离菌灭活苗的免疫研究
    1
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 实验仪器
            1.1.3 实验试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 灭活条件选择及灭活苗制备
            1.2.2 灭活苗安全性检测
            1.2.3 灭活苗免疫接种
            1.2.4 血清溶菌酶活力测定
            1.2.5 血清C3补体活力测定
            1.2.6 抗体滴度检测
            1.2.7 疫苗免疫保护力
    2 实验结果
        2.1 灭活菌灭活条件选择
        2.2 灭活苗安全性检测
        2.3 血清溶菌酶活性
        2.4 血清C3补体含量测定
        2.5 抗体滴度测定
        2.6 疫苗保护率的测定
    3 讨论
第四章 龟类细胞原代培养
    1 实验材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 主要仪器
            1.1.3 主要试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 原代培养
            1.2.2 传代细胞培养
    2 实验结果
        2.1 细胞贴壁情况
        2.2 原代培养结果
        2.3 细胞传代培养
    3 讨论
第五章 罗非鱼脑细胞系建立及细菌刺激下免疫因子调控
    1.实验材料与方法
        1.1 材料与方法
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 实验仪器
            1.1.3 实验试剂
        1.2 实验方法
            1.2.1 罗非鱼脑细胞的原代培养
            1.2.2 罗非鱼脑细胞传代培养
            1.2.3 细胞冻存与复苏
            1.2.4 细胞最适条件筛选
            1.2.5 细菌刺激下免疫因子的调控
    2 结果
        2.1 原代培养
        2.2 罗非鱼脑细胞传代结果
        2.3 冻存细胞的复苏
            2.3.1 最适培养基
            2.3.2 最适温度
            2.3.3 最适血清浓度
        2.4 RT-qPCR方法检测免疫因子的调控
    3 讨论
结论
参考文献
致谢



本文编号：3182850