敲除TRIM47斑马鱼脑和脾的转录组学分析及USP5抗病毒研究
发布时间：2021-06-01 22:04
免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统,机体内很多蛋白受外界刺激后,会激活免疫系统。TRIM家族和USP家族蛋白在生命的多个过程中发挥着重要作用。三结构域蛋白（Tripartite motif Protein,TRIM）是一种结构保守的蛋白,在许多生物过程中发挥重要作用,例如细胞凋亡、细胞周期调节、细胞对病毒的应答和炎症反应等。本研究选用免疫器官脾脏及TRIM47鲤鱼中高表达组织脑作为实验材料,通过对敲除TRIM47斑马鱼的脑和脾进行转录组学分析,阐明TRIM47在斑马鱼中可能发挥的作用,以及研究USP5蛋白在天然免疫中发挥的作用及其机制探讨。为进一步了解硬骨鱼类的天然免疫提供一定的理论基础。主要内容如下:1. 敲除TRIM47斑马鱼脑和脾的转录组学分析本研究采用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼的TRIM47基因,收集TRIM47-/-（TRIM47敲除）和WT（野生型）斑马鱼的脑和脾脏进行RNA-seq分析,鉴定差异表达基因（Difference Expression Genes,DEGs）。在这项研究中与野生型斑马鱼相比在敲除组鉴定出271个脑和...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
USP5预测四泛素结合位点的示意图(Ningetal2019)
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文5图1.2SVCV及其基因组示意图(Ashrafetal2016)Figure1.2SchematicofSVCVanditsgenome(Ashrafetal2016)对于SVCV的检测，现在已有多种针对SVCV的检测方法，细胞培养以及酶联免疫吸附和PCR结合法是其中最经典的方法(王姝等2014)；还有使用SYBRGreenⅠ作为荧光染料的荧光定量(RT-PCR)法取检测病毒，间接ELISA法，焦磷酸测序检测法，流式细胞筛选法，数字RT-PCR法以及病毒核酸适配体筛选分析法(安伟等2015;高隆英等2002;刘瑶等2017;王津津等2015;吴斌等2015;于力等2017)。目前，大多数实验室应用最广泛的是细胞培养与PCR结合法以及荧光定量检测法检测SVCV。
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文61.5基因敲除技术的应用近年来，有着设计简单、效率高、操作方便、成本低并且可同时进行多位点编辑等优势的CRISPR/Cas9技术,已成为当今最热的新一代基因编辑技术。CRISPR(聚簇有规律间隔的短回文重复序列)/Cas9(CRISPR相关)基因组编辑系统已成为基础生物医学研究和治疗应用中最强大的平台之一(Lietal2018)。簇状规则间隔的回文重复序列(CRISPR)是指细菌基因组中的序列。当与一系列CRISPR相关(Cas)蛋白结合使用时，可提供针对入侵病毒的保护。Cas9是一种内切核酸酶的相关蛋白，可以切割两条DNA链。通过人工合成单链，Cas9通过一段RNA定向至其靶标，即为合成单向导RNA(sgRNA)；与基因组DNA结合的RNA片段为18–20个核苷酸。为了进行切割，必须在指导RNA的3"端放置一个2至5个核苷酸的特定DNA序列(确切的序列取决于产生Cas9的细菌)：这称为原间隔子相邻基序。DNA切割后的修复可能通过两种途径进行：非同源末端连接，通常会导致DNA的随机插入/缺失，或同源指导的修复，其中将DNA的同源片段用作修复模板。后者允许精确的基因组编辑：具有所需序列改变的DNA同源部分可以与Cas9核酸酶和sgRNA一起提供，理论上允许精确到单个碱基对(如图1.3Redmanetal2016)。图1.3基因敲除示意图(Redmanetal.2016)Figure1.3Geneknockoutschematic(Redmanetal.2016)
【参考文献】：
期刊论文
[1]鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立[J]. 刘瑶,尹伟力,张四化,岳志芹,孙涛. 水产科学. 2017(04)
[2]鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析[J]. 于力,王津津,卢奕良,郑晓聪,贾鹏,何俊强,史秀杰,刘莹,刘荭. 中国动物检疫. 2017(02)
[3]流式细胞仪在快速测定鲤春病毒血症病毒滴度中的应用[J]. 王津津,贾鹏,史秀杰,于力,阮周曦,郑晓聪,何俊强,兰文升,宋思静,刘荭. 中国动物检疫. 2015(09)
[4]鲤春病毒血症病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立[J]. 安伟,肖雨,张明辉,高晓华,何正侃. 中国预防兽医学报. 2015(09)
[5]数字RT-PCR检测鲤春病毒血症的方法建立与应用[J]. 吴斌,申翠翠,张晨曦,胡德聪,肇慧君,张琳. 中国动物检疫. 2015(07)
[6]鲤春病毒血症监测方法的应用研究[J]. 王姝,曹欢,王小亮,王静波,徐立蒲. 检验检疫学刊. 2014(06)
[7]斑马鱼免疫学研究进展[J]. 谢英,张力,刘树锋. 实验动物科学. 2013(03)
[8]用RT-PCR法快速检测鲤春病毒血症病毒基因[J]. 高隆英,史秀杰,刘荭,江育林. 水生生物学报. 2002(05)
博士论文
[1]斑马鱼tnni1b基因敲除导致心脏房室瓣膜发育异常的机制研究[D]. 蔡陈.华中科技大学 2018
本文编号：3210239
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
USP5预测四泛素结合位点的示意图(Ningetal2019)
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文5图1.2SVCV及其基因组示意图(Ashrafetal2016)Figure1.2SchematicofSVCVanditsgenome(Ashrafetal2016)对于SVCV的检测，现在已有多种针对SVCV的检测方法，细胞培养以及酶联免疫吸附和PCR结合法是其中最经典的方法(王姝等2014)；还有使用SYBRGreenⅠ作为荧光染料的荧光定量(RT-PCR)法取检测病毒，间接ELISA法，焦磷酸测序检测法，流式细胞筛选法，数字RT-PCR法以及病毒核酸适配体筛选分析法(安伟等2015;高隆英等2002;刘瑶等2017;王津津等2015;吴斌等2015;于力等2017)。目前，大多数实验室应用最广泛的是细胞培养与PCR结合法以及荧光定量检测法检测SVCV。
华中农业大学2020届硕士研究生学位（毕业）论文61.5基因敲除技术的应用近年来，有着设计简单、效率高、操作方便、成本低并且可同时进行多位点编辑等优势的CRISPR/Cas9技术,已成为当今最热的新一代基因编辑技术。CRISPR(聚簇有规律间隔的短回文重复序列)/Cas9(CRISPR相关)基因组编辑系统已成为基础生物医学研究和治疗应用中最强大的平台之一(Lietal2018)。簇状规则间隔的回文重复序列(CRISPR)是指细菌基因组中的序列。当与一系列CRISPR相关(Cas)蛋白结合使用时，可提供针对入侵病毒的保护。Cas9是一种内切核酸酶的相关蛋白，可以切割两条DNA链。通过人工合成单链，Cas9通过一段RNA定向至其靶标，即为合成单向导RNA(sgRNA)；与基因组DNA结合的RNA片段为18–20个核苷酸。为了进行切割，必须在指导RNA的3"端放置一个2至5个核苷酸的特定DNA序列(确切的序列取决于产生Cas9的细菌)：这称为原间隔子相邻基序。DNA切割后的修复可能通过两种途径进行：非同源末端连接，通常会导致DNA的随机插入/缺失，或同源指导的修复，其中将DNA的同源片段用作修复模板。后者允许精确的基因组编辑：具有所需序列改变的DNA同源部分可以与Cas9核酸酶和sgRNA一起提供，理论上允许精确到单个碱基对(如图1.3Redmanetal2016)。图1.3基因敲除示意图(Redmanetal.2016)Figure1.3Geneknockoutschematic(Redmanetal.2016)
【参考文献】：
期刊论文
[1]鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立[J]. 刘瑶,尹伟力,张四化,岳志芹,孙涛. 水产科学. 2017(04)
[2]鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析[J]. 于力,王津津,卢奕良,郑晓聪,贾鹏,何俊强,史秀杰,刘莹,刘荭. 中国动物检疫. 2017(02)
[3]流式细胞仪在快速测定鲤春病毒血症病毒滴度中的应用[J]. 王津津,贾鹏,史秀杰,于力,阮周曦,郑晓聪,何俊强,兰文升,宋思静,刘荭. 中国动物检疫. 2015(09)
[4]鲤春病毒血症病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立[J]. 安伟,肖雨,张明辉,高晓华,何正侃. 中国预防兽医学报. 2015(09)
[5]数字RT-PCR检测鲤春病毒血症的方法建立与应用[J]. 吴斌,申翠翠,张晨曦,胡德聪,肇慧君,张琳. 中国动物检疫. 2015(07)
[6]鲤春病毒血症监测方法的应用研究[J]. 王姝,曹欢,王小亮,王静波,徐立蒲. 检验检疫学刊. 2014(06)
[7]斑马鱼免疫学研究进展[J]. 谢英,张力,刘树锋. 实验动物科学. 2013(03)
[8]用RT-PCR法快速检测鲤春病毒血症病毒基因[J]. 高隆英,史秀杰,刘荭,江育林. 水生生物学报. 2002(05)
博士论文
[1]斑马鱼tnni1b基因敲除导致心脏房室瓣膜发育异常的机制研究[D]. 蔡陈.华中科技大学 2018
本文编号：3210239
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