萍乡红鲫卵母细胞组化及ZP（zona pellucida）基因的分子特征和表达分析

发布时间：2021-06-23 04:35

　　萍乡红鲫（Pingxiang red-transparent crucian carp, Carassius auratus var.Pingxiangnensis,简写CaP）,分布于中国江西省萍乡地区，是一种自然野生的三倍体鲫鱼突变体，具有雌核发育和两性生殖两种方式。关于萍乡红鲫卵膜透明带基因（ZonaPellucida genes of CaP, CaP_ZP）表达和调控的研究很少。本研究包括以下四个部分：一，应用细胞化学方法研究了萍乡红鲫卵子发生过程中主要生物大分子的变化。从1时相卵母细胞发育到2时相卵母细胞，可见蛋白质沉积。但过碘酸-雪夫反应（Periodic acidSchiff，PAS反应）和苏丹黑反应为阴性。随着卵母细胞的继续发育，糖类和脂类在卵母细胞质中出现。结果显示，成熟卵母细胞包含了大量蛋白质、糖类和脂类，为成功受精以及胚胎发育作好准备。二，利用蔗糖-尿素法来分离纯化萍乡红鲫卵母细胞卵壳蛋白，SDS-PAGE胶分析显示位于40-70kDa的四条卵膜蛋白条带分子量大小与已经获得的萍乡红鲫CaP_ZP2和CaP_Z

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：88 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 鱼类与其它动物受精生物学
    1.2 透明带 (zona pellucida) ZP 基因研究概况
        1.2.1 透明带的组成与结构特征
        1.2.2 ZP 基因功能研究进展
    1.3 本研究的内容、目的及意义
第二章 萍乡红鲫卵母细胞中蛋白、糖类和脂肪的组化分析
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
        2.2.1 蛋白质的显色方法（DNFB 法）
        2.2.2 糖原显色方法(PAS 反应)
        2.2.3 脂类显色方法（溴-苏丹黑法）
    2.3 实验结果
        2.3.1 不同时相的卵母细胞 DNFB 染色
        2.3.2 不同时相的卵母细胞中 PAS 染色
        2.3.3 卵母细胞中溴-苏丹黑染色脂类
    2.4 讨论
第三章 萍乡红鲫 ZP 基因克隆及其基因组结构分析
    3.1 实验材料
    3.2 实验方法
        3.2.1 萍乡红鲫卵壳蛋白的分离和纯化
        3.2.2 RACE-PCR 引物设计
        3.2.3 萍乡红鲫卵巢组织总 RNA 提取
        3.2.4 RNA 反转录成 cDNA
        3.2.5 萍乡红鲫 ZP2 基因 cDNA 全长克隆
        3.2.6 萍乡红鲫四个基因组 DNA 文库的构建
        3.2.7 GenomeWalker 法步移 ZP 基因组及其启动子序列
        3.2.8 回收目的片段，与载体连接，感受态细胞制备以及转化测序
    3.3 实验结果
        3.3.1 萍乡红鲫卵壳蛋白的分离纯化
        3.3.2 萍乡红鲫 ZP2 基因全长克隆和序列分析
        3.3.3 萍乡红鲫 ZP3 基因 cDNA 以及 domain 结构域分析
        3.3.4 萍乡红鲫四个基因组 DNA 文库的构建
        3.3.5 步移 ZP2 基因启动子序列以及 ZP3.2 基因组序列
        3.3.6 步移 ZP2 基因组序列以及 ZP3.1 基因组序列
        3.3.7 萍乡红鲫 ZP3.1，ZP2 和 ZP3.2 基因组序列拼接和图示
        3.3.8 分析 ZP2 和 ZP3.2 启动子序列
    3.4 讨论
        3.4.1 萍乡红鲫卵壳蛋白组分分析
        3.4.2 萍乡红鲫 ZP2 和 ZP3 基因序列分析
        3.4.3 萍乡红鲫基因组结构以及启动子序列分析
第四章 萍乡红鲫 ZP 基因表达模式及其启动子活性分析
    4.1 实验材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 萍乡红鲫多个组织总 RNA 提取
        4.2.2 RNA 反转录成 cDNA
        4.2.3 荧光定量 PCR 检测萍乡红鲫 ZP 基因的表达
        4.2.4 ZP2 基因原位杂交分析
        4.2.5 构建萍乡红鲫 ZP3 和 ZP2 基因启动子与 GFP 的表达载体
        4.2.6. 瞬时转染质粒进入 COS-7 细胞
    4.3 结果
        4.3.1 萍乡红鲫 ZP2 基因多个组织的差异性表达
        4.3.2 萍乡红鲫卵母细胞不同发育时期 ZP2 和 ZP3 基因的表达
        4.3.3 萍乡红鲫 ZP2 和 ZP3 基因启动子活性分析
    4.4 讨论
        4.4.1 萍乡红鲫多个组织 ZP2 基因差异性表达
        4.4.2 萍乡红鲫卵母细胞不同发育时期 ZP2 和 ZP3 基因的表达分析
        4.4.3 萍乡红鲫 ZP 基因启动子
参考文献
致谢
攻读学位期间的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3244241