刺参MMP及TIMP基因的克隆及在自溶过程中的变化研究

发布时间：2021-06-24 03:47

　　海参是一种对外界环境极其敏感的动物,环境理化因素的变化都能诱发其自溶,造成细胞外基质蛋白的降解。基质金属蛋白酶是一大类细胞外蛋白水解酶,几乎可以降解细胞外基质的所有成分。MMPs的活性受基质金属蛋白酶抑制剂的严格调控。前期研究表明,MMP是参与海参自溶的一类重要蛋白酶。而海参自溶过程中,MMP及TIMP在基因水平的表达情况尚无报道。因此,本文克隆了海参MMP-1和TIMP-1基因,对其组织分布及自溶过程中的表达情况进行了研究。以期从MMP-1/TIMP-1基因表达调控的角度,揭示海参自溶机制。提取海参肠RNA,逆转录后采用PCR扩增及RACE,得到MMP-1及TIMP-1基因序列。采用实时荧光定量RT-PCR法检测其在海参六种组织及自溶过程中的表达水平。结果表明,MMP-1全长cDNA为1691bp,编码507个氨基酸；TIMP-1全长cDNA包含721bp,编码192个氨基酸。在体壁背部、体壁腹部、肠道、呼吸树、体腔液细胞和纵行肌中,MMP-1在呼吸树中的相对表达量最高,TIMP-1在体腔细胞中的相对表达量最高；海参自溶过程中两个基因的表达量均呈现先上调后下降的趋势,自溶6h,管足和... 

【文章来源】：大连工业大学辽宁省

【文章页数】：84 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 海参简介
    1.2 海参自溶与蛋白酶
    1.3 基质金属蛋白酶简介
        1.3.1 细胞外基质(ECM)
        1.3.2 MMPs的结构
        1.3.3 MMPs的分类和特点
        1.3.4 MMPs的研究进展
    1.4 内源性基质金属蛋白酶抑制剂简介
        1.4.1 内源性蛋白酶抑制剂
        1.4.2 TIMPs的分类及功能
        1.4.3 TIMPs的研究进展
    1.5 MMP及TIMP相互作用
    1.6 立题背景和意义
第二章 海参MMP和TIMP全长序列的克隆及生物信息学分析
    2.1 前言
    2.2 实验材料与方法
        2.2.1 实验原料
        2.2.2 实验设备
        2.2.3 实验试剂
            2.2.3.1 海参Total RNA的提取与纯化
            2.2.3.2 引物的设计与合成
            2.2.3.3 cDNA的合成
        2.2.4 目的基因cDNA全长序列的获取
            2.2.4.1 特异性片段的获取
            2.2.4.2 3'RACE扩增
        2.2.5 目的基因ORF验证及测序
            2.2.5.1 PCR扩增
            2.2.5.2 PCR产物的纯化
            2.2.5.3 PCR产物的克隆及验证
            2.2.5.4 质粒提取及测序
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 总RNA提取检验
        2.3.2 海参MMP序列及生物信息学分析
            2.3.2.1 海参MMP序列的获取
            2.3.2.2 cDNA全长序列的生物信息学分析结果
        2.3.3 海参TIMP序列及生物信息学分析结果
            2.3.3.1 海参TIMP序列的获取
            2.3.3.2 cDNA全长序列的生物信息学分析结果
    2.4 小结
第三章 海参自溶过程中MMP-1及TIMP-1的基因表达
    3.1 前言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 实验材料
            3.2.1.1 实验原料及处理
            3.2.1.2 实验设备
            3.2.1.3 实验试剂
        3.2.2 实验方法
            3.2.2.0 海参Total RNA的提取与纯化
            3.2.2.1 RNA纯化及反转
            3.2.2.2 引物的设计与合成
            3.2.2.3 荧光Real-Time PCR
            3.2.2.4 建立标准曲线
            3.2.2.5 样品检测及数据处理
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 RNA提取结果
        3.3.2 Real-Time PCR检测方法的建立
            3.3.2.1 Cyt-b基因标准曲线的建立
            3.3.2.2 MMP-1基因标准曲线的建立
            3.3.2.3 TIMP-1基因标准曲线的建立
        3.3.3 Real-Time PCR定量结果
            3.3.3.1 MMP-1和TIMP-1的组织分布
            3.3.3.3 时序表达结果
    3.4 小结
第四章 海参TIMP-1的蛋白重组表达
    4.1 前言
    4.2 实验材料与方法
        4.2.1 实验材料
            4.2.1.1 实验设备
            4.2.1.2 实验试剂
        4.2.2 实验方法
            4.2.2.1 引物的设计与合成
            4.2.2.2 PCR扩增及产物纯化
            4.2.2.3 表达质粒的构建及测序
            4.2.2.4 诱导表达及鉴定
            4.2.2.5 诱导表达条件的优化及鉴定
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 质粒构建及测序
        4.3.2 重组蛋白诱导表达
        4.3.3 重组蛋白诱导表达条件优化
    4.4 小结
结论
展望
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂的提取、纯化及其特性[J]. 胡新颖,刘欢,张楠,马长伟.  中国水产科学. 2006(02)
[2]基质金属蛋白酶研究进展[J]. 刘丰彬,段立公.  山西体育科技. 2005(03)
[3]基质金属蛋白酶和消化道肿瘤的相关性[J]. 范玉晶,韩明子.  世界华人消化杂志. 2004(09)
[4]植物种子的蛋白酶抑制剂及其生理功能[J]. 文方德,傅家瑞.  植物生理学通讯. 1997(01)
[5]细胞外基质的研究进展[J]. 金博,李玉彬.  医学理论与实践. 1996(03)
[6]鱼类自溶作用[J]. 戴志远.  浙江水产学院学报. 1990(01)



本文编号：3246301