拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能及其受体结合域的确定
发布时间：2021-07-05 23:17
拟态弧菌（Vibrio mimicus, Vm）是一种广宿主病原菌,可感染各种水产养殖动物引起腹水病,严重威胁我国水产养殖业的健康发展。细菌黏附是病原菌引发感染的关键起始步骤,其实质是细菌黏附素与宿主受体之间相互作用,使病原菌选择性地定植于宿主细胞表面,继而生长繁殖,产生毒力因子或侵入深部,损伤组织细胞,导致疾病的发生。从分子水平探明特定病原菌的黏附素及其关键功能域,设计和创制基于关键功能域的新型黏附拮抗剂,是目前细菌性疾病防治的新策略。我们的前期研究结果表明：拟态弧菌外膜蛋白U （OmpU）是一种较为保守的抗原蛋白,具有6个免疫优势B细胞线性表位,该蛋白N末端含有黏附素基序,抗OmpU抗体可抑制细菌对人源上皮细胞的黏附,推测OmpU可能是拟态弧菌的黏附素。从前述重要的实验现象出发,本研究以鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma Papulosum Cyprinid, EPC）作为细胞黏附模型,建立检测细菌或蛋白黏附特性的技术平台,确证OmpU蛋白的黏附功能,深入解析其受体关键结合域,从而为创制新型黏附拮抗剂提供理论支持。主要研究内容包括：1拟态弧菌的黏附特性测定以EPC细胞作为细胞黏...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－３?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ?２００）??Ｆｉｇ．?２－３?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?（ｘ２００）??
２．２．３化学因子对拟态弧茵黏附性的影响??用糖类和蛋白酶类等化学因子预处理菌体后，进行细胞黏附试验，结果显示不同??化学因子对拟态弧菌黏附活性的影响不同。由表２－２和图２－６可（＾看出膜酶、蛋白酶Ｋ、??半郭糖完全阻断拟态弧菌０４－１４菌株对ＥＰＣ细胞的黏附，与细菌黏附对照组差异极显??著（ｐ＜０．００１）；细菌经就糖、藤糖、葡萄糖、甘露糖和麦芽糖处理后对ＥＰＣ细胞的平??均黏附数分别为?１８．３３＋４．９１、１９．０?＋?４．７４、１９．９?＋?４．４９、１６．４?＋?５．１２?和?１８．５?＋?４．１３，与??细菌黏附对照组（２２．２?＋?４．６）差异不昆著扭＞０．０５）。对肤酶和蛋白酶Ｋ处理敏感，提??示拟态弧菌的黏附素为蛋白质；对半乳糖敏感，说明与该黏附素相结合的受体结构中??存在寡糖链结构，其中的半乳糖残基决定其特异性。??２．３?■基因巧光原核表达质粒的构建与表达??２．３．１化？／平基因的ＰＣ民扩增??ｙｘ阳ＧＦＰ－Ｎ１为模板，Ｐ１、Ｐ２为引物ＰＣＲ扩增巧堪因，结果如图２－７所示，??在约７３５?ｂｐ处出现一明亮的ＤＮＡ条带，大小与己知￡ＧＥＰ基因的分子量大小相符。??２．３．２?Ｏｗｐｔ／基因黄光原核表达质粒的鉴定??用说脚ＨＩ／＆ＷＩ双酶切ＥＧ／乎基因片段和重组表达质粒ｐＥＴ－３２ａ－ＯｍｐＵ
趣鱼上皮瘤细胞巧ＰＣ）用含１０％胎牛血清的Ｍ１９９培养液，在饱和湿度２８°Ｃ、５％??Ｃ化培养箱培养２仙后，倒置相差思微镜下即可见细胞呈单层贴壁生长，８０％融合，培??养３化长满，细胞形态卓＿多角形或不规则形（图２－１，２－２和２－３）。??國圍??图２－１?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ４０）?图２－２?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ?１００）??Ｆｉｇ．２－１?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?｛＞＜４０）?Ｆｉｇ．２－２?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?（＞＾１００）??ｊ．’Ｘ；乂知??图２－３?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ?２００）??Ｆｉｇ．?２－３?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?（ｘ２００）??２２??
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立[J]. 纪燕,熊祺琰,韦艳娜,马庆红,白方方,冯志新,刘茂军,邵国青. 中国人兽共患病学报. 2014(03)
[2]创伤弧菌外膜蛋白OmpU的基因克隆与表达[J]. 李素一,吴唯维,李盼,柯翎,许斌福,林晨韬,林天龙,陈叙. 福建农业学报. 2013(06)
[3]流式细胞术测定蠕形螨基因组大小[J]. 苏磊,郭淑玲,冯玉新,肖克源,朱晓丽,袁方曙. 山东大学学报(医学版). 2013(06)
[4]Antiflammin-1与NIH 3T3细胞的结合特性[J]. 李晨,史小娟,冯丹丹,李金凤,汉建忠,罗自强. 湖南师范大学学报(医学版). 2013(01)
[5]噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽[J]. 唐波,黄定德,郑磊,任浩,李前伟. 第三军医大学学报. 2013(01)
[6]大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究[J]. 高正勇,曾令兵,肖汉兵,张辉,孟彦,肖艺,徐进. 淡水渔业. 2012(05)
[7]尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白T敲除株的构建及功能评价[J]. 赵铁,方幸幸,刘晓露,彭亮,龙敏,张文炳,罗军,曹虹. 南方医科大学学报. 2012(07)
[8]动物源产肠毒素大肠杆菌（ETEC）黏附素研究进展[J]. 周虹,朱军,朱国强. 微生物学报. 2012(06)
[9]流式细胞术分析神经系统疾病患者脑脊液T淋巴细胞亚群[J]. 蔡蓓,冯伟华,李立新,王兰兰. 检验医学. 2012(05)
[10]炭疽芽胞杆菌BslA（260-652）蛋白的表达纯化与黏附功能鉴定[J]. 马坤,王艳春,陶好霞,董杰,曹诚,张部昌,刘纯杰. 微生物学报. 2012(03)
博士论文
[1]肝癌细胞系HepG2特异性结合短肽的筛选及其特异性研究[D]. 李文涵.华中科技大学 2007
[2]重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的鉴定及其特异性免疫调节作用的研究[D]. 王宏坤.第四军医大学 2006
硕士论文
[1]初免加强免疫增强肺炎链球菌表面黏附素（psaA）核酸疫苗免疫原性研究[D]. 章德广.复旦大学 2009
本文编号：3267025
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－３?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ?２００）??Ｆｉｇ．?２－３?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?（ｘ２００）??
２．２．３化学因子对拟态弧茵黏附性的影响??用糖类和蛋白酶类等化学因子预处理菌体后，进行细胞黏附试验，结果显示不同??化学因子对拟态弧菌黏附活性的影响不同。由表２－２和图２－６可（＾看出膜酶、蛋白酶Ｋ、??半郭糖完全阻断拟态弧菌０４－１４菌株对ＥＰＣ细胞的黏附，与细菌黏附对照组差异极显??著（ｐ＜０．００１）；细菌经就糖、藤糖、葡萄糖、甘露糖和麦芽糖处理后对ＥＰＣ细胞的平??均黏附数分别为?１８．３３＋４．９１、１９．０?＋?４．７４、１９．９?＋?４．４９、１６．４?＋?５．１２?和?１８．５?＋?４．１３，与??细菌黏附对照组（２２．２?＋?４．６）差异不昆著扭＞０．０５）。对肤酶和蛋白酶Ｋ处理敏感，提??示拟态弧菌的黏附素为蛋白质；对半乳糖敏感，说明与该黏附素相结合的受体结构中??存在寡糖链结构，其中的半乳糖残基决定其特异性。??２．３?■基因巧光原核表达质粒的构建与表达??２．３．１化？／平基因的ＰＣ民扩增??ｙｘ阳ＧＦＰ－Ｎ１为模板，Ｐ１、Ｐ２为引物ＰＣＲ扩增巧堪因，结果如图２－７所示，??在约７３５?ｂｐ处出现一明亮的ＤＮＡ条带，大小与己知￡ＧＥＰ基因的分子量大小相符。??２．３．２?Ｏｗｐｔ／基因黄光原核表达质粒的鉴定??用说脚ＨＩ／＆ＷＩ双酶切ＥＧ／乎基因片段和重组表达质粒ｐＥＴ－３２ａ－ＯｍｐＵ
趣鱼上皮瘤细胞巧ＰＣ）用含１０％胎牛血清的Ｍ１９９培养液，在饱和湿度２８°Ｃ、５％??Ｃ化培养箱培养２仙后，倒置相差思微镜下即可见细胞呈单层贴壁生长，８０％融合，培??养３化长满，细胞形态卓＿多角形或不规则形（图２－１，２－２和２－３）。??國圍??图２－１?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ４０）?图２－２?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ?１００）??Ｆｉｇ．２－１?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?｛＞＜４０）?Ｆｉｇ．２－２?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?（＞＾１００）??ｊ．’Ｘ；乂知??图２－３?ＥＰＣ细胞形态（Ｘ?２００）??Ｆｉｇ．?２－３?Ｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＥＰＣ?ｃｅｌｌｓ?（ｘ２００）??２２??
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立[J]. 纪燕,熊祺琰,韦艳娜,马庆红,白方方,冯志新,刘茂军,邵国青. 中国人兽共患病学报. 2014(03)
[2]创伤弧菌外膜蛋白OmpU的基因克隆与表达[J]. 李素一,吴唯维,李盼,柯翎,许斌福,林晨韬,林天龙,陈叙. 福建农业学报. 2013(06)
[3]流式细胞术测定蠕形螨基因组大小[J]. 苏磊,郭淑玲,冯玉新,肖克源,朱晓丽,袁方曙. 山东大学学报(医学版). 2013(06)
[4]Antiflammin-1与NIH 3T3细胞的结合特性[J]. 李晨,史小娟,冯丹丹,李金凤,汉建忠,罗自强. 湖南师范大学学报(医学版). 2013(01)
[5]噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽[J]. 唐波,黄定德,郑磊,任浩,李前伟. 第三军医大学学报. 2013(01)
[6]大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究[J]. 高正勇,曾令兵,肖汉兵,张辉,孟彦,肖艺,徐进. 淡水渔业. 2012(05)
[7]尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白T敲除株的构建及功能评价[J]. 赵铁,方幸幸,刘晓露,彭亮,龙敏,张文炳,罗军,曹虹. 南方医科大学学报. 2012(07)
[8]动物源产肠毒素大肠杆菌（ETEC）黏附素研究进展[J]. 周虹,朱军,朱国强. 微生物学报. 2012(06)
[9]流式细胞术分析神经系统疾病患者脑脊液T淋巴细胞亚群[J]. 蔡蓓,冯伟华,李立新,王兰兰. 检验医学. 2012(05)
[10]炭疽芽胞杆菌BslA（260-652）蛋白的表达纯化与黏附功能鉴定[J]. 马坤,王艳春,陶好霞,董杰,曹诚,张部昌,刘纯杰. 微生物学报. 2012(03)
博士论文
[1]肝癌细胞系HepG2特异性结合短肽的筛选及其特异性研究[D]. 李文涵.华中科技大学 2007
[2]重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的鉴定及其特异性免疫调节作用的研究[D]. 王宏坤.第四军医大学 2006
硕士论文
[1]初免加强免疫增强肺炎链球菌表面黏附素（psaA）核酸疫苗免疫原性研究[D]. 章德广.复旦大学 2009
本文编号：3267025
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