两种过氧化物还原酶在日本囊对虾先天免疫中的功能研究

发布时间：2021-07-06 13:48

　　研究背景先天免疫是生物体在长期的进化中获得的一种抵御外界病原微生物入侵的天然防御机制,是宿主启动免疫应答的基础。无脊椎动物仅具备先天免疫系统,因而是研究先天免疫应答机制的理想生物。无脊椎动物先天免疫研究在以果蝇和线虫为代表的模式生物中取得了较大的进展,获得了深入的认识。近年来,以对虾为代表的海洋无脊椎动物养殖业发展迅速,但也频繁遭受病害的侵袭。因此,需要深入研究对虾的先天免疫应答机制,为相关产业的病害防控提供理论参考与技术支持。研究的科学问题及意义已知,在需氧生物中,由过氧化物歧化酶和过氧化氢酶等组成的抗氧化酶系统在生物体的先天免疫应答中发挥着重要功能。近期的研究成果表明,过氧化物还原酶（Peroxiredoxin, Prx）,作为一类多功能的、广泛分布的硫醇依赖性的抗氧化酶,可能参与先天免疫应答。但是,其在先天免疫应答中的具体功能和发挥作用的分子机制尚不明确。因此,在本论文中我们选择具有重要经济价值的无脊椎动物日本囊对虾作为实验材料,深入研究Prx1亚型在对虾抗白斑综合症病毒（White spot syndrome virus, WSSV）先天免疫和1-Cys Prx6亚家族蛋白在对... 

【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词
第一章 文献综述
    一、生物体抗氧化系统组成
    二、过氧化物还原酶研究进展
        1、过氧化物还原酶的发现、命名、分类
        2. 过氧化物还原酶的酶促反应机制
    三.过氧化物还原酶与动物先天免疫
    四、日本囊对虾中prx基因的鉴定
    五、本论文研究的主要科学问题
第二章 过氧化物还原酶1在日本囊对虾抗病毒先天免疫中的功能及其作用机制研究
    一、前言
    二、实验材料与方法
        1. 实验材料
            1.1 实验动物
            1.2 菌株与质粒
            1.3 棉铃虫表皮细胞系
            1.4 实验试剂
        2. 实验方法
            2.1 病毒感染
            2.2 组织总蛋白质提取
            2.3 重组表达载体的构建
            2.4 重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备
            2.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)
            2.6 RNA干扰实验
            2.7 存活率统计实验
            2.8 免疫细胞化学(Immunocytochemistry)
            2.9 核质蛋白分离实验
            2.10 染色质免疫共沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)
            2.11 实时定量PCR
            2.12 免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
            2.13 HaEpi细胞系过表达实验
            2.14 HaEpi细胞中MjDorsal~(RHD)结构域二聚化的检测
    三、结果
        1、WSSV感染能够诱导MjPrx1上调表达
        2、干扰Mjprx1能够抑制WSSV在对虾体内的复制
        3、注射MjPrx1重组蛋白促进对虾体内WSSV复制
        4、干扰Mjprx1抑制MjDorsal的核移位和WSSV ie1启动子结合活性
        5、MjPrx1能够与MjDorsal相互作用并介导其形成二硫键连接的同源二聚体
        6. MjPrx1与MjDorsal的相互作用依赖于MjPrx1的Cys51残基
        7. MjPrx1的Cys51位在其促进WSSV复制的功能中发挥关键作用
    四、讨论
第三章 1-Cys亚型过氧化物还原酶在日本囊对虾抗细菌免疫中的功能与分子机理研究
    一、前言
    二、实验材料与方法
        1. 实验材料
            1.1 实验动物
            1.2 菌株与质粒
            1.3 实验试剂
        2. 实验方法
            2.1 细菌感染
            2.2 组织总RNA、蛋白提取
            2.3 cDNA逆转录合成
            2.4 重组表达载体的构建
            2.5 重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备
            2.6 蛋白质免疫印迹(Western Blot)
            2.7 RNA干扰实验
            2.8 存活率统计实验
            2.9 实时定量PCR和半定量RT-PCR
            2.10 细菌清除实验
            2.11 对虾体内H_2O_2测定
            2.12 注射抗氧化剂NAC和外源H_2O_2
            2.13 重组蛋白回补实验
    三、实验结果
        1、MjPrx6在日本囊对虾抗细菌免疫中发挥重要作用
        2、干扰Mjprx6抑制鳗弧菌感染诱导的AMP基因上调表达
        3、Mjprx6干扰引起对虾体内H_2O_2水平的异常升高
        4、NAC能够修复Mjprx6干扰引起的H_2O_2异常升高和AMP基因表达抑制
        5、MjAlfA1、MjAlfCI和MjAlfC2基因的表达受H_2O_2浓度的双向调节
        6、MjPrx6重组蛋白能够修复Mjprx6干扰组对虾的异常表型
        7、MjAlfC1和MjAlfC2在对虾抗细菌先天免疫中发挥重要功能
    四、讨论
参考文献
已发表或整理的文章
致谢
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本文编号：3268357