以鱼类过敏性毒素C5a为分子佐剂的鱼类DNA疫苗开发
发布时间：2021-07-14 00:02
补体激活过程中释放的过敏性毒素C5a片段具有强烈的促炎反应,可以迅速激活多种炎症细胞释放细胞因子,产生强烈的免疫激活效果,具有作为疫苗分子佐剂的巨大潜力。本文以鱼类来源的过敏性毒素C5a作为候选分子佐剂,以鱼类重要细菌性病原迟钝爱德华氏菌的细菌载体疫苗以及重组蛋白疫苗为考察对象,在斑马鱼模型上初步证明了C5a具有促进疫苗免疫保护效果的作用,可作为分子佐剂进行鱼类疫苗的进一步开发。为了开发更为有效的鱼类DNA疫苗,我们对真核表达载体pcDNA3.1+进行了优化设计,将原有CMV启动子改造为添加了人T细胞白血病病毒长末端重复序列LTR的CMV/R启动子,同时添加土拨鼠转录后调节元件WPRE,从而构建了新的真核表达系统pc3.1-CW,上述表达系统具有显著增强的表达效果。基于上述优化过的真核表达系统pc3.1-CW,我们构建了同时表达迟钝爱德华氏菌保护性抗原ETAE-1227和分子佐剂C5a的候选疫苗。基于斑马鱼模型的疫苗免疫保护效果及免疫因子分析表明：以C5a为分子佐剂,采用双质粒共转染和双顺反子表达的方式所构建的DNA疫苗既能激活细胞免疫又能激活体液免疫,均能产生60%以上的免疫保护效果...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
第1章 文献综述
1.1 鱼类细菌性病害
1.2 鱼类疫苗的发展及种类
1.2.1 灭活疫苗
1.2.2 减毒活疫苗
1.2.3 载体疫苗
1.2.4 亚单位疫苗
1.2.5 DNA疫苗
1.3 分子佐剂
1.3.1 分子佐剂的作用机制
1.3.2 分子佐剂的分类
1.3.3 过敏性毒素C3a、C5a
1.3.4 过敏性毒素C3a、C5a作为佐剂的研究
1.3.5 鱼类过敏性毒素C5a研究进展
1.4 课题研究背景及意义
第2章 鱼类过敏性毒素C5a的基因克隆
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验用培养基
2.2.2 实验用引物,质粒和菌株
2.2.3 实验试剂
2.3 实验方法
2.3.1 鱼类过敏性毒素C5a序列的推定
2.3.2 斑马鱼C5a的基因克隆
2.3.3 罗非鱼及虹鳟C5a基因获得
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 鱼类C5a序列的获得
2.4.2 斑马鱼C5a基因克隆
2.4.3 罗非鱼及虹鳟C5a的基因克隆
2.5 本章小结
第3章 以过敏性毒素C5a为佐剂的重组蛋白疫苗及细菌载体疫苗构建
3.1 引言
3.2 实验用材料
3.2.1 实验用菌株、质粒、引物
3.2.2 实验用试剂
3.3 实验方法
3.3.1 抗原与佐剂表达载体的构建
3.3.2 重组抗原及佐剂蛋白的表达纯化
3.3.3 载体疫苗体外诱导表达与检测
3.3.4 斑马鱼的免疫与攻毒
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 抗原GAPDH的表达载体构建与表达纯化
3.4.2 佐剂C5a的表达载体构建
3.4.3 佐剂与抗原融合蛋白的表达载体构建与蛋白纯化
3.4.4 载体疫苗蛋白表达检测
3.4.5 载体疫苗动物实验免疫保护力分析
3.5 本章小结
第4章 以过敏性毒素C5a为佐剂的DNA疫苗开发
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验用菌株,质粒及引物
4.2.2 实验用试剂
4.3 实验方法
4.3.1 DNA疫苗的构建
4.3.2 斑马鱼的免疫与攻毒
4.3.3 DNA疫苗免疫保护力的测定
4.4 实验结果分析及讨论
4.4.1 DNA疫苗PNl-GAPDH-C5a/dArg C5a的构建
4.4.2 斑马鱼的免疫攻毒
4.5 本章小结
第5章 以过敏性毒素C5a为佐剂的DNA疫苗优化
5.1 引言
5.2 实验用材料
5.2.1 实验用菌株,质粒及引物
5.2.2 实验用试剂
5.3 实验方法
5.3.1 单基因表达系统优化
5.3.2 双基因表达系统的优化
5.3.3 优化系统在细胞模型上的评估
5.4 实验结果与讨论
5.4.1 单基因表达系统优化
5.4.2 基因表达系统优化
5.4.3 表达质粒质量检测
5.4.4 HEK293细胞及EPC细胞最佳转染比例确定
5.4.5 单基因表达系统评估
5.4.6 双基因表达系统细胞模型评估
5.5 本章小结
第6章 候选疫苗的免疫效力评价
6.1 前言
6.2 实验材料
6.3 实验方法
6.3.1 携带穿膜肽裂解系统的载体疫苗体外诱导表达及免疫剂量确定
6.3.2 候选DNA疫苗免疫剂量的确定
6.3.3 斑马鱼免疫与组织提取
6.3.4 组织DNA目的基因扩增检测
6.3.5 组织内目的基因转录水平检测
6.3.6 免疫相关基因转录水平的检测
6.3.7 DNA疫苗免疫保护力的测定
6.4 实验结果与讨论
6.4.1 携带裂解系统及穿膜肽的载体疫苗免疫保护力分析
6.4.2 携带裂解系统及穿膜肽的载体疫苗免疫应答过程中相关免疫因子分析
6.4.3 DNA疫苗质量检测
6.4.4 免疫后组织内抗原基因1227的PCR检测
6.4.5 DNA疫苗给药剂量的确定
6.4.6 C5a佐剂配合DNA疫苗使用的免疫保护力分析
6.4.7 DNA疫苗免疫应答过程中相关免疫因子分析
6.5 本章小结
第7章 结论与展望
7.1 结论
7.2 展望
参考文献
致谢
本文编号：3282987
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
第1章 文献综述
1.1 鱼类细菌性病害
1.2 鱼类疫苗的发展及种类
1.2.1 灭活疫苗
1.2.2 减毒活疫苗
1.2.3 载体疫苗
1.2.4 亚单位疫苗
1.2.5 DNA疫苗
1.3 分子佐剂
1.3.1 分子佐剂的作用机制
1.3.2 分子佐剂的分类
1.3.3 过敏性毒素C3a、C5a
1.3.4 过敏性毒素C3a、C5a作为佐剂的研究
1.3.5 鱼类过敏性毒素C5a研究进展
1.4 课题研究背景及意义
第2章 鱼类过敏性毒素C5a的基因克隆
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验用培养基
2.2.2 实验用引物,质粒和菌株
2.2.3 实验试剂
2.3 实验方法
2.3.1 鱼类过敏性毒素C5a序列的推定
2.3.2 斑马鱼C5a的基因克隆
2.3.3 罗非鱼及虹鳟C5a基因获得
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 鱼类C5a序列的获得
2.4.2 斑马鱼C5a基因克隆
2.4.3 罗非鱼及虹鳟C5a的基因克隆
2.5 本章小结
第3章 以过敏性毒素C5a为佐剂的重组蛋白疫苗及细菌载体疫苗构建
3.1 引言
3.2 实验用材料
3.2.1 实验用菌株、质粒、引物
3.2.2 实验用试剂
3.3 实验方法
3.3.1 抗原与佐剂表达载体的构建
3.3.2 重组抗原及佐剂蛋白的表达纯化
3.3.3 载体疫苗体外诱导表达与检测
3.3.4 斑马鱼的免疫与攻毒
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 抗原GAPDH的表达载体构建与表达纯化
3.4.2 佐剂C5a的表达载体构建
3.4.3 佐剂与抗原融合蛋白的表达载体构建与蛋白纯化
3.4.4 载体疫苗蛋白表达检测
3.4.5 载体疫苗动物实验免疫保护力分析
3.5 本章小结
第4章 以过敏性毒素C5a为佐剂的DNA疫苗开发
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验用菌株,质粒及引物
4.2.2 实验用试剂
4.3 实验方法
4.3.1 DNA疫苗的构建
4.3.2 斑马鱼的免疫与攻毒
4.3.3 DNA疫苗免疫保护力的测定
4.4 实验结果分析及讨论
4.4.1 DNA疫苗PNl-GAPDH-C5a/dArg C5a的构建
4.4.2 斑马鱼的免疫攻毒
4.5 本章小结
第5章 以过敏性毒素C5a为佐剂的DNA疫苗优化
5.1 引言
5.2 实验用材料
5.2.1 实验用菌株,质粒及引物
5.2.2 实验用试剂
5.3 实验方法
5.3.1 单基因表达系统优化
5.3.2 双基因表达系统的优化
5.3.3 优化系统在细胞模型上的评估
5.4 实验结果与讨论
5.4.1 单基因表达系统优化
5.4.2 基因表达系统优化
5.4.3 表达质粒质量检测
5.4.4 HEK293细胞及EPC细胞最佳转染比例确定
5.4.5 单基因表达系统评估
5.4.6 双基因表达系统细胞模型评估
5.5 本章小结
第6章 候选疫苗的免疫效力评价
6.1 前言
6.2 实验材料
6.3 实验方法
6.3.1 携带穿膜肽裂解系统的载体疫苗体外诱导表达及免疫剂量确定
6.3.2 候选DNA疫苗免疫剂量的确定
6.3.3 斑马鱼免疫与组织提取
6.3.4 组织DNA目的基因扩增检测
6.3.5 组织内目的基因转录水平检测
6.3.6 免疫相关基因转录水平的检测
6.3.7 DNA疫苗免疫保护力的测定
6.4 实验结果与讨论
6.4.1 携带裂解系统及穿膜肽的载体疫苗免疫保护力分析
6.4.2 携带裂解系统及穿膜肽的载体疫苗免疫应答过程中相关免疫因子分析
6.4.3 DNA疫苗质量检测
6.4.4 免疫后组织内抗原基因1227的PCR检测
6.4.5 DNA疫苗给药剂量的确定
6.4.6 C5a佐剂配合DNA疫苗使用的免疫保护力分析
6.4.7 DNA疫苗免疫应答过程中相关免疫因子分析
6.5 本章小结
第7章 结论与展望
7.1 结论
7.2 展望
参考文献
致谢
本文编号：3282987
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