海豚链球菌CAMP因子原核表达及生物学特性研究
发布时间：2021-07-30 12:47
本研究以斑点叉尾鮰源海豚链球菌（Streptococcus iniae, S. iniae）广西分离株DGX07为实验菌株提取总DNA作为模板,对CAMP因子基因进行PCR（Polymerase Chain Reaction）扩增；将扩增产物连接至pMD19-T质粒中进行测序,并应用不同的生物信息学软件对其核酸及氨基酸序列进行分析；将含有限制性内切酶位点的cfi基因连接至pMD19-T质粒中,酶切回收后将其连接至表达质粒pET32a（+）上,最终转化至大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）原核表达系统BL21（DE3）大肠杆菌内；将阳性表达菌株进行CAMP因子重组诱导表达,并优化表达条件；用重组CAMP因子蛋白免疫新西兰大白兔,并进行Western-blot以检验该蛋白的免疫原性以及在海豚链球菌中的表达情况；用Western-blot检验重组CAMP因子对IgG非特异性的粘附；用CAMP因子抗血清探究其对海豚链球菌对鲤鱼上皮瘤细胞（Epithelioma papulosum cyprini, EPC）粘附及侵染的抑制水平；用重组CAMP因子与重组金黄色葡萄球菌（S...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1. 海豚链球菌的研究进展
1.1 海豚链球菌简介
1.2 海豚链球菌的全球传播
1.3 海豚链球菌的宿主
2. 海豚链球菌主要致病因子
2.1 SiM蛋白
2.2 C5a肽酶
2.3 白细胞介素-8蛋白酶
2.4 链球菌溶血素S
2.5 免疫结合蛋白
2.6 荚膜
2.7 葡萄糖磷酸变位酶
2.8 表多糖
2.9 α-烯醇化酶
3. CAMP因子概述
3.1 CAMP因子简介
3.2 CAMP因子的溶血特性
3.3 CAMP因子溶血机理
3.4 CAMP因子非特异性结合免疫球蛋白
3.5 CAMP因子致病性
第二章 实验目的以及意义
第三章 cfi的克隆和生物信息学分析及其蛋白原核表达
1 实验材料
1.1 材料与试剂
1.2 实验仪器
1.3 实验试剂
2 实验步骤
2.1 cfi基因的扩增及序列分析
2.1.1 海豚链球菌DNA的提取
2.1.2 cfi基因引物设计
2.1.3 cfi基因的PCR扩增
2.2 重组cfi基因的T载体克隆构建
2.2.1 pMD19-T-cfi的构建、测序及生物信息学分析
2.2.2 pMD19-T-cfi转化至感受态细胞
2.3 cfi基因表达载体pET-32a(+)的构建
2.3.1 表达质粒pET-32a(+)的制备
2.3.2 表达质粒pET-32a(+)-cfi的构建
2.3.3 表达质粒pET-32a(+)-cfi转化至感受态细胞
2.4 CAMP因子重组蛋白表达条件的优化
2.4.1 重组蛋白在宿主菌中的分布
2.4.2 诱导温度、IPTG浓度以及诱导时间的优化
2.5 镍NTA琼脂糖凝胶过柱纯化重组蛋白
3 实验结果
3.1 海豚链球菌cfi基因的扩增
3.2 海豚链球菌CAMP因子生物信息学分析
3.3 pMD19-T-cfi克隆载体的构建
3.4 pET-32a(+)-cfi表达载体的构建
3.5 CAMP因子重组蛋白的表达与优化
3.6 重组蛋白的纯化
4 分析与讨论
4.1 海豚链球菌CAMP因子生物信息学分析
4.2 海豚链球菌CAMP因子原核表达
第四章 重组CAMP因子生物学特性研究
1 实验材料
1.1 实验动物
1.2 实验材料
1.3 实验试剂
2 实验步骤
2.1 CAMP因子兔抗血清的制备
2.2 CAMP因子抗血清特异性检测
2.3 CAMP因子非特异性结合免疫球蛋白检测
2.4 鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)粘附/侵染实验
2.4.1 EPC细胞的传代培养
2.4.2 重组CAMP因子粘附EPC细胞
2.4.3 重组CAMP因子入侵EPC细胞
2.5 重组CAMP因子促溶血实验
2.5.1 金黄色葡萄球菌鞘磷脂酶的原核表达及纯化
2.5.2 CAMP因子血平板促溶血检测
2.5.3 血细胞悬液的制备
2.5.4 CAMP因子液体促溶血检测
3 实验结果
3.1 CAMP因子抗血清琼脂扩散实验
3.2 CAMP因子免疫原性实验
3.3 CAMP因子在海豚链球菌中表达情况的检验
3.4 CAMP因子非特异性结合IgG
3.5 CAMP因子协助海豚链球菌粘附/入侵EPC细胞
3.6 CAMP因子血平板促溶血检测
3.7 CAMP因子液体促溶血检测
4 分析与讨论
4.1 CAMP因子的免疫原性
4.2 CAMP因子非特异性结合IgG
4.3 CAMP因子协助海豚链球菌粘附/入侵EPC细胞
4.4 CAMP因子对不同动物红细胞促溶血作用
参考文献
致谢
本文编号：3311429
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1. 海豚链球菌的研究进展
1.1 海豚链球菌简介
1.2 海豚链球菌的全球传播
1.3 海豚链球菌的宿主
2. 海豚链球菌主要致病因子
2.1 SiM蛋白
2.2 C5a肽酶
2.3 白细胞介素-8蛋白酶
2.4 链球菌溶血素S
2.5 免疫结合蛋白
2.6 荚膜
2.7 葡萄糖磷酸变位酶
2.8 表多糖
2.9 α-烯醇化酶
3. CAMP因子概述
3.1 CAMP因子简介
3.2 CAMP因子的溶血特性
3.3 CAMP因子溶血机理
3.4 CAMP因子非特异性结合免疫球蛋白
3.5 CAMP因子致病性
第二章 实验目的以及意义
第三章 cfi的克隆和生物信息学分析及其蛋白原核表达
1 实验材料
1.1 材料与试剂
1.2 实验仪器
1.3 实验试剂
2 实验步骤
2.1 cfi基因的扩增及序列分析
2.1.1 海豚链球菌DNA的提取
2.1.2 cfi基因引物设计
2.1.3 cfi基因的PCR扩增
2.2 重组cfi基因的T载体克隆构建
2.2.1 pMD19-T-cfi的构建、测序及生物信息学分析
2.2.2 pMD19-T-cfi转化至感受态细胞
2.3 cfi基因表达载体pET-32a(+)的构建
2.3.1 表达质粒pET-32a(+)的制备
2.3.2 表达质粒pET-32a(+)-cfi的构建
2.3.3 表达质粒pET-32a(+)-cfi转化至感受态细胞
2.4 CAMP因子重组蛋白表达条件的优化
2.4.1 重组蛋白在宿主菌中的分布
2.4.2 诱导温度、IPTG浓度以及诱导时间的优化
2.5 镍NTA琼脂糖凝胶过柱纯化重组蛋白
3 实验结果
3.1 海豚链球菌cfi基因的扩增
3.2 海豚链球菌CAMP因子生物信息学分析
3.3 pMD19-T-cfi克隆载体的构建
3.4 pET-32a(+)-cfi表达载体的构建
3.5 CAMP因子重组蛋白的表达与优化
3.6 重组蛋白的纯化
4 分析与讨论
4.1 海豚链球菌CAMP因子生物信息学分析
4.2 海豚链球菌CAMP因子原核表达
第四章 重组CAMP因子生物学特性研究
1 实验材料
1.1 实验动物
1.2 实验材料
1.3 实验试剂
2 实验步骤
2.1 CAMP因子兔抗血清的制备
2.2 CAMP因子抗血清特异性检测
2.3 CAMP因子非特异性结合免疫球蛋白检测
2.4 鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)粘附/侵染实验
2.4.1 EPC细胞的传代培养
2.4.2 重组CAMP因子粘附EPC细胞
2.4.3 重组CAMP因子入侵EPC细胞
2.5 重组CAMP因子促溶血实验
2.5.1 金黄色葡萄球菌鞘磷脂酶的原核表达及纯化
2.5.2 CAMP因子血平板促溶血检测
2.5.3 血细胞悬液的制备
2.5.4 CAMP因子液体促溶血检测
3 实验结果
3.1 CAMP因子抗血清琼脂扩散实验
3.2 CAMP因子免疫原性实验
3.3 CAMP因子在海豚链球菌中表达情况的检验
3.4 CAMP因子非特异性结合IgG
3.5 CAMP因子协助海豚链球菌粘附/入侵EPC细胞
3.6 CAMP因子血平板促溶血检测
3.7 CAMP因子液体促溶血检测
4 分析与讨论
4.1 CAMP因子的免疫原性
4.2 CAMP因子非特异性结合IgG
4.3 CAMP因子协助海豚链球菌粘附/入侵EPC细胞
4.4 CAMP因子对不同动物红细胞促溶血作用
参考文献
致谢
本文编号：3311429
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3311429.html
