无乳链球菌分选酶A的表达、纯化与活性检测
发布时间：2021-08-08 05:57
以提取的无乳链球菌ATCC51487菌株全基因组为模板,通过PCR扩增出srtAΔN82基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切、抗性筛选等方法构建重组表达载体,测定不同诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间对表达产物的影响,利用亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,并使用荧光共振能量转移法测定蛋白活性。结果显示,试验构建的pGEX-6p-1-srtAΔN82载体转化至BL21（DE3）后,在37℃条件下经1 mmol/L IPTG诱导表达6 h后可得到大量的可溶性蛋白,且纯度大于85%。纯化后的SrtAΔN82与底物作用后,可显著提高反应体系的荧光强度,表明得到的SrtAΔN82具有较好的生物学活性。
【文章来源】：华中农业大学学报. 2020,39(04)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
菌液PCR扩增电泳图
为分析srtAΔN82基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中是否表达,通过蛋白电泳分析了加入IPTG(1 mmol/L)诱导前后的菌体总蛋白。如图4所示,经IPTG诱导后的大肠杆菌在分子质量约为42 ku 处有明显的条带,而诱导前的菌体在该位置有微弱的表达条带,且该条带的分子质量与GST-SrtAΔN82融合蛋白的理论分子质量42 ku一致。以上结果表明,本试验构建的pGEX-6p-1-srtAΔN82原核表达载体在大肠杆菌BL21 (DE3) 中能够表达。图4 SrtAΔN82预表达SDS - PAGE电泳图
图3 重组载体双酶切电泳图为了获得SrtAΔN82的可溶性表达,试验分析了37 ℃和16 ℃ 2个温度下的表达形式。如图5所示,16 ℃和 37 ℃条件下细菌裂解液上清中均有目的蛋白,表明该2种不同温度下SrtAΔN82均能可溶性表达,且在37 ℃条件下表达量较高。此外,通过对诱导时间的分析发现,加入IPTG后继续诱导6 h可以得到最大表达量(图6)。因此,本试验确定的诱导表达温度为37 ℃,诱导剂IPTG浓度为1 mmol/L,诱导时间6 h。
【参考文献】：
期刊论文
[1]嗜水气单胞菌气溶素的表达纯化和活性实验[J]. 董靖,刘永涛,胥宁,杨秋红,杨移斌,艾晓辉. 中国渔业质量与标准. 2019(01)
[2]中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用[J]. 李焯新,蔡小辉,黄瑜,王蓓. 广东海洋大学学报. 2016(04)
[3]强阴离子交换色谱结合分子排阻色谱纯化血清中免疫球蛋白和白蛋白[J]. 秦宗华,陈婷,李任强. 色谱. 2012(08)
[4]分选酶A在pET32a（+）原核表达载体中的表达和鉴定[J]. 朱芳,邓思,罗立新. 生物技术通报. 2011(06)
[5]罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因的克隆和分子特性分析[J]. 汪开毓,付希,肖丹,黄锦炉,王均,王浩丞. 水产学报. 2011(05)
[6]γ-突触核蛋白的克隆、表达及纯化[J]. 刘晓娟,张力青,李健,翟方丽,李慎涛. 首都医科大学学报. 2011(02)
[7]天然藻胆蛋白纯化技术研究进展[J]. 王超,薛勇,刘鑫,张莉莉,李兆杰,薛长湖. 食品工业科技. 2011(04)
[8]抗耐药金黄色葡萄球菌新药的研究进展[J]. 杨应虹,罗有福,李子成. 华西药学杂志. 2010(04)
[9]酵母表面展示分选酶底物用于分选酶活性检测[J]. 罗立新,吴琳,林影. 微生物学报. 2009(11)
[10]新抗菌靶点分选酶基因（srtA）在两种原核载体中的克隆表达[J]. 罗立新,江彬强,陈谋通. 微生物学报. 2009(02)
博士论文
[1]黄芩苷抗金黄色葡萄球菌α-溶血素作用靶位的确证[D]. 邱家章.吉林大学 2012
[2]肺炎链球菌Gts、PotD及SrtA蛋白联合免疫对其感染的保护作用及肺炎链球菌外膜蛋白SPD1741和SPD0280的初步晶体学研究[D]. 闵迅.重庆医科大学 2012
硕士论文
[1]查尔酮抗金黄色葡萄球菌分选酶A和α-溶血素的作用研究[D]. 张冰.吉林大学 2018
[2]GST-SrtA融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定[D]. 邓思.华南理工大学 2012
[3]抗感染新靶点分选酶A的酵母展示系统的构建研究[D]. 吴琳.华南理工大学 2010
[4]猪链球菌2型强毒株srtA基因缺失株的构建及其毒力分析[D]. 董亚青.南京农业大学 2007
本文编号：3329370
【文章来源】：华中农业大学学报. 2020,39(04)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
菌液PCR扩增电泳图
为分析srtAΔN82基因在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中是否表达,通过蛋白电泳分析了加入IPTG(1 mmol/L)诱导前后的菌体总蛋白。如图4所示,经IPTG诱导后的大肠杆菌在分子质量约为42 ku 处有明显的条带,而诱导前的菌体在该位置有微弱的表达条带,且该条带的分子质量与GST-SrtAΔN82融合蛋白的理论分子质量42 ku一致。以上结果表明,本试验构建的pGEX-6p-1-srtAΔN82原核表达载体在大肠杆菌BL21 (DE3) 中能够表达。图4 SrtAΔN82预表达SDS - PAGE电泳图
图3 重组载体双酶切电泳图为了获得SrtAΔN82的可溶性表达,试验分析了37 ℃和16 ℃ 2个温度下的表达形式。如图5所示,16 ℃和 37 ℃条件下细菌裂解液上清中均有目的蛋白,表明该2种不同温度下SrtAΔN82均能可溶性表达,且在37 ℃条件下表达量较高。此外,通过对诱导时间的分析发现,加入IPTG后继续诱导6 h可以得到最大表达量(图6)。因此,本试验确定的诱导表达温度为37 ℃,诱导剂IPTG浓度为1 mmol/L,诱导时间6 h。
【参考文献】：
期刊论文
[1]嗜水气单胞菌气溶素的表达纯化和活性实验[J]. 董靖,刘永涛,胥宁,杨秋红,杨移斌,艾晓辉. 中国渔业质量与标准. 2019(01)
[2]中草药与抗生素联用对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑菌作用[J]. 李焯新,蔡小辉,黄瑜,王蓓. 广东海洋大学学报. 2016(04)
[3]强阴离子交换色谱结合分子排阻色谱纯化血清中免疫球蛋白和白蛋白[J]. 秦宗华,陈婷,李任强. 色谱. 2012(08)
[4]分选酶A在pET32a（+）原核表达载体中的表达和鉴定[J]. 朱芳,邓思,罗立新. 生物技术通报. 2011(06)
[5]罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因的克隆和分子特性分析[J]. 汪开毓,付希,肖丹,黄锦炉,王均,王浩丞. 水产学报. 2011(05)
[6]γ-突触核蛋白的克隆、表达及纯化[J]. 刘晓娟,张力青,李健,翟方丽,李慎涛. 首都医科大学学报. 2011(02)
[7]天然藻胆蛋白纯化技术研究进展[J]. 王超,薛勇,刘鑫,张莉莉,李兆杰,薛长湖. 食品工业科技. 2011(04)
[8]抗耐药金黄色葡萄球菌新药的研究进展[J]. 杨应虹,罗有福,李子成. 华西药学杂志. 2010(04)
[9]酵母表面展示分选酶底物用于分选酶活性检测[J]. 罗立新,吴琳,林影. 微生物学报. 2009(11)
[10]新抗菌靶点分选酶基因（srtA）在两种原核载体中的克隆表达[J]. 罗立新,江彬强,陈谋通. 微生物学报. 2009(02)
博士论文
[1]黄芩苷抗金黄色葡萄球菌α-溶血素作用靶位的确证[D]. 邱家章.吉林大学 2012
[2]肺炎链球菌Gts、PotD及SrtA蛋白联合免疫对其感染的保护作用及肺炎链球菌外膜蛋白SPD1741和SPD0280的初步晶体学研究[D]. 闵迅.重庆医科大学 2012
硕士论文
[1]查尔酮抗金黄色葡萄球菌分选酶A和α-溶血素的作用研究[D]. 张冰.吉林大学 2018
[2]GST-SrtA融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定[D]. 邓思.华南理工大学 2012
[3]抗感染新靶点分选酶A的酵母展示系统的构建研究[D]. 吴琳.华南理工大学 2010
[4]猪链球菌2型强毒株srtA基因缺失株的构建及其毒力分析[D]. 董亚青.南京农业大学 2007
本文编号：3329370
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