鱼源无乳链球菌小鼠血脑屏障开放评估模型的建立及cas9基因功能分析

发布时间：2021-08-08 15:29

　　无乳链球菌（Streptococcus agalctiae）,亦称 B 群链球菌（Group B Streptococcus,GBS）,具有广泛的宿主感染范围,不仅能引起新生儿脑膜炎及肺炎和奶牛乳腺炎,还可引致鱼类脑膜炎和败血症。近年来,无乳链球菌已成为鱼类重要致病菌之一,其传染性强,死亡率高,给水产养殖业造成惨重经济损失,严重制约了我国罗非鱼养殖业的稳定发展。研究发现,无乳链球菌对鱼类的致死率可达100%,但其致病机制尚不清楚。因此,研究其致病机制对防控鱼类无乳链球菌病至关重要。1鱼源无乳链球菌小鼠血脑屏障开放评估模型的建立本试验筛选出一株产β-半乳糖苷酶大肠杆菌M5,毒力测定得知其对小鼠半数致死量（LD50）>2×109CFU;各脏器细菌载量分析表明,该菌不能穿透血脑屏障（BBB）进入中枢神经系统,因此该菌可作为小鼠血脑屏障开放程度的指示菌。在此基础上,对小鼠腹腔注射l00μL浓度为103CFU/mL的无乳链球菌GD201008-001,并于注射后3h、6h、9h和12h,通过尾静脉注射大肠杆菌M5 100μL（2×108CFU）,于5min后眼球采血并处死小鼠,无菌取脑,涂... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一篇 文献综述
    第一章 无乳链球菌致病机制研究进展
        1 无乳链球菌的致病性
            1.1 对人的致病性
            1.2 对奶牛的致病性
            1.3 对水产动物的致病性
        2 毒力因子及其致病作用
            2.1 GBS表面蛋白
            2.2 β-溶血素
            2.3 透明质酸酶
            2.4 脂磷壁酸
        3 无乳链球菌与宿主的互作机制
            3.1 无乳链球菌与宿主细胞互作
            3.2 无乳链球菌感染动物模型的建立
        4 小结
        参考文献
第二篇 实验研究
    第二章 鱼源无乳链球菌小鼠血脑屏障开放评估模型的建立
        1 材料与方法
            1.1 菌株及实验动物
            1.2 仪器和试剂
            1.3 大肠杆菌M5的筛选
            1.4 大肠杆菌M5对小鼠LD50的测定
            1.5 大肠杆菌M5在小鼠血液中的代谢速率测定
            1.6 大肠杆菌M5对BBB开放程度的指示作用测定
        2 结果
            2.1 大肠杆菌M5的筛选
            2.2 大肠杆菌M5对小鼠LD50
            2.3 大肠杆菌M5在小鼠血液中的代谢速率测定
            2.4 M5对小鼠BBB开放程度的指示作用
        3 讨论
        参考文献
    第三章 无乳链球菌透明质酸酶的表达及其对小鼠的致病作用
        1 材料与方法
            1.1 菌株、质粒和实验动物
            1.2 试剂
            1.3 引物的设计与合成
            1.4 hylB份基因的克隆及原核表达载体的构建
            1.5 重组蛋白的表达与纯化
            1.6 重组蛋白的Western blot检测
            1.7 重组蛋白活性检测
            1.8 重组蛋白对小鼠攻毒试验
        2 结果
            2.1 hylB基因PCR扩增和重组质粒的双酶切
            2.2 重组蛋白的表达及纯化
            2.3 重组蛋白的Western blot检测
            2.4 Hyl重组蛋白降解透明质酸的活性检测
            2.5 重组蛋白注射后小鼠的临床表现
            2.6 重组蛋白注射后小鼠的组织病理学变化
        3 讨论
        参考文献
    第四章 鱼源无乳链球菌cas9基因缺失株和互补株的构建
        1 材料与方法
            1.1 菌株、质粒与引物
            1.2 仪器和试剂
            1.3 cas9基因缺失载体的构建
            1.4 cas9基因缺失株的构建
            1.5 目的基因互补株的构建
            1.6 缺失株和互补株的荧光定量PCR鉴定
            1.7 遗传稳定性分析
        2 结果
            2.1 无乳链球菌cas9基因上下游臂的PCR扩增
            2.2 基因缺失质粒的构建
            2.3 基因互补质粒的构建
            2.4 基因缺失株的PCR鉴定
            2.5 荧光定量PCR分析cas9基因的表达
            2.6 遗传稳定性分析
        3 讨论
        参考文献
    第五章 鱼源无乳链球菌cas9基因缺失株生物学特性分析
        1 材料与方法
            1.1 菌株、细胞系和实验动物
            1.2 主要试剂和仪器
            1.3 特性分析
        2 结果
            2.1 生长曲线的测定
            2.2 小鼠巨噬细胞的吞噬实验
            2.3 小鼠脑微血管内皮细胞的黏附试验
            2.4 斑马鱼LD_(50)的测定
            2.5 巨噬细胞胞内存活试验
            2.6 小鼠的存活时间比较
            2.7 cas9基因缺失株中hylB基因表达水平的检测
            2.8 cas9基因缺失株的Hyl活性检测
            2.9 不同菌株和Hyl致小鼠血脑屏障BBB开放程度的检测
        3 讨论
        参考文献
全文总结
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]我国奶牛乳房炎无乳链球菌抗生素耐药性研究[J]. 李宏胜,罗金印,王旭荣,李新圃,王玲,杨峰,张世栋,苗小楼.  中兽医医药杂志. 2012(06)
[2]中国南方地区罗非鱼无乳链球菌的分子流行病学研究[J]. 郭玉娟,张德锋,樊海平,陈学年,李彤彤,李爱华.  水产学报. 2012(03)
[3]2型猪链球菌层粘连蛋白结合蛋白的原核表达及免疫原性检测[J]. 潘秀珍,邵珠卿,李先富,刘文静,王长军,唐家祺.  中国人兽共患病学报. 2011(07)
[4]中国奶牛乳房炎防治研究进展[J]. 宋亚攀,杨利国.  中国奶牛. 2010(12)
[5]罗非鱼出口比较优势与贸易结构耦合性分析[J]. 王斌,李晓钟.  世界农业. 2010(02)
[6]奶牛乳腺炎研究进展[J]. 曹访,唐修君,陈丽,王杏龙.  黑龙江动物繁殖. 2006(04)
[7]奶牛乳房炎类型与病原菌感染之间相关性的研究[J]. 李宏胜,郁杰,李新圃,罗金印,徐继英,张礼华,潘虎,张志常,袁永隆,杨玉英,刘纯传,侯奕昭.  动物医学进展. 2004(06)



本文编号：3330211