斜带石斑鱼AMH/AMHRⅡ基因克隆鉴定、原核表达及多克隆抗体制备
发布时间：2021-08-14 16:39
斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）隶属于鲈形目、鲈亚目、鮨科、石斑鱼亚科、石斑鱼属,是一种生活在海水中具有较高营养价值和自然性逆转的雌雄同体鱼类,可以作为研究脊椎动物性别分化的模型。抗缪勒氏管激素（anti-Mullerian hormone,AMH）及受体（anti-Mullerian hormone receptor II,AMHRII）为糖蛋白,属于TGF-β细胞因子家族。AMH基因在哺乳类研究中是因其具有引发缪勒氏管的退化和阻止雌性生殖器官的发育而得以命名。在硬骨鱼类中,虽然没有缪勒氏管存在,但在许多鱼类中AMH及其受体AMHRII基因都已被克隆鉴定,并且在性腺中检测到其表达,从而进一步证明了 AMH及其受体AMHRII基因在鱼类性别分化和性逆转方面起着某种作用。本文利用RACE方法克隆了 AMH及其受体AMHRII基因的全长cDNA序列并对其进行进化分析;利用RT-PCR方法对AMH及其受体AMHRII基因在不同组织器官中的表达量进行检测;并利用原位杂交的方法对AMH及其受体AMHRII基因在性腺中的表达进行定位;在对AMH及其受体AMHRII基因所扮演的作...
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．?（Ａ／Ｂ）斜带石斑鱼克隆得到的目的片段点泳检测??
可编码一个包含５１８个氨基酸的蛋白（图２．?Ａ）。而斜带石斑鱼中ＡＭＨＲＩＩ受体基??因序列长为１８２２ｂｐ，含有１４９７?ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），可编码一个包含４９８??个氨基酸的蛋白（图２．?Ｂ）。我们对ＡＭＨ和ＡＭＨＲＩＩ进行了基因序列Ｎ端信号肽??预测，信号肽长度分别为２２个和２１个氨基酸，如（图２．?Ａ）和（图２．?Ｂ）中红色阴影??表示。??ａｔｇｃｔｇｔｔｔｇｔｇｇａｃａｔｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇｇａｇｃｇｔｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｇｃｃｃｇｇｃｔｃｔｇｔｇｃａｇｃｃｃｔｇｃａｇｇｔｃｔｃａｃａｔｇｇａｃａｇｃａｇ??ｌｑｖｓｈｇｑｑ??ｃｔｇａｔｔｇａｃｇａｃｃｃｃｇｃａｇｔｇａｃａｇａｇｃａｃａｃｃｃａｔｃｃａｔｃａｇｃｃｔｃｃａｃａｇｔｃｔｃｃｃａｔｃａｃｇｃｃｃｃｔｃａｃａｇｔｇｃａｃｃｇｔｇｃｔｔｔｇｔｇ??ＬＩＤＤＰＡＶＴＥＨＴＨＰＳＡＳＴＶＳＨＨＡＰＨＳＡＰＣＦ！??ｇａｔｇａｃａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇｃｔｇｃｇｔｇａａｇｇｔｇｔｔｇｇｇａｇｃｇａｃｇｇｔｇａａｃｔｃａｃａａａｃｃｇｃａｇｔｔｔｇｇｃｔｃａｇｔｔｔｇｇｇａｔｃｔｇｃａｃｔｇａａ??ｔｃｔｇａｃａｇｃｔｃｔｔｃａｇｔｃｔｔａｔｔａｃａｇｃｔｇｇｃｔａａｔｇａａａｃａａａｃａａａａａｃｃａｇｇｇａａａｔｇｇａｔｔｇａａｇｇｔｔｔｔｇｃａｔｃｃａｇｇｔｇｇａｇｇａ??ａｔｃａｇａｇｇｔｇｔｃａａａｇａｔｇａｇａｃｇｇｇａａｃｔｃｔｃｇｔｇｔｔｇａｃｃｔｔｔｇａｃｃｔｃｔｃａｃｔｇｔｃｃｃｃｔｔｔｇｃｔｇａａｇｇｔｇａａｃｃｃｔｇｔｇｔｔｇｃｔｇ??ｔｔｇｇｃｇｔｔｔｇａａａｇ
中最后留存的为线性化质粒，于－２０Ｔ：保存。??述过程中所用的明和其他耗材均为ＲＮａｓｅ?ｆｒｅｅ。??反转录??线性化质粒浓度后，我们对线性化质粒进行反转录，具体反应成分?体积（ｕＬ）线性化质粒（ｌｕｇ）?Ｘ??ＲＮａｓｅ?ｆｒｅｅ?Ｈ２Ｏ?１３－Ｘ??ｌ〇ｘＮＴＰ?ｌａｂｅｌｉｎｇ?ｍｉｘｔｕｒｅ?２．?０??ｌ〇ｘＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｂｕｆｆｅｒ?２．?０??ＰｒｏｔｅｃｔｏｒＲＮａｓｅ?ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒ?１．０??Ｐ６?ＲＮＡ?ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?（Ｔ７为正?２．?０??向，ＳＰ６为反向）?２０．０??Ｔｏｔａｌ??件为：冰上混匀后３７°Ｃ，?２ｈ；加入２ｕＬ?ＤＮａｓｅｌ后，３７°Ｃ，１ＥＤＴＡ终止反应。分装后产物于－８０°Ｃ保存。浓度一般为２０－ｌ
【参考文献】：
期刊论文
[1]半滑舌鳎抗缪勒氏管激素（AMH）基因的克隆及组织表达分析[J]. 刘姗姗,孙冰,梁卓,张静,陈松林. 中国水产科学. 2013(01)
[2]细胞受体的种类与功能[J]. 汪静儿,钟万锷. 生物学教学. 2012(08)
[3]罗非鱼AMH基因的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 丁炜东,曹哲明,曹丽萍. 水产学报. 2010(05)
[4]凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析[J]. 姚翠鸾,冀培丰,孔鹏,王志勇. 水产学报. 2009(06)
[5]奥利亚罗非鱼AMH基因结构及其表达[J]. 唐永凯,李建林,俞菊华. 水产学报. 2009(03)
[6]抑制素、活化素和卵泡抑素研究进展[J]. 田锦,李志敏,傅衍,王振玲,周珍辉,齐军喆,孙建. 动物医学进展. 2008(12)
[7]石斑鱼性逆转研究现状[J]. 邢晨光,金珊,袁思平. 水产科学. 2006(04)
[8]斜带石斑鱼人工育苗技术的初步研究[J]. 史海东,辛俭,毛国民,於海滨. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2004(01)
[9]脊椎动物性别决定和分化的分子机制研究进展[J]. 周林燕,张修月,王德寿. 动物学研究. 2004(01)
[10]抗苗勒氏管激素（AMH）对卵巢功能的调节[J]. 陈秀萍,丁利军,丁家桐. 上海畜牧兽医通讯. 2004(01)
硕士论文
[1]尼罗罗非鱼Dmrt1、Amh和Cyp11b2抗体制备及其在正常发育和性逆转性腺中的表达研究[D]. 王婷茹.西南大学 2013
[2]黄河鲤和两种泥鳅中AMH基因的克隆及其表达分析[D]. 豆晓飞.河南师范大学 2013
[3]半滑舌鳎AMH基因的克隆及表达分析[D]. 刘姗姗.上海海洋大学 2012
[4]Vasa、卵泡抑素（FST）和抗缪勒氏管激素（AMH）在半滑舌鳎繁殖周期中的作用研究[D]. 张远青.中国海洋大学 2012
[5]两种生防活性蛋白HarpinXooc和AiiA的表达及生物活性检测[D]. 何丹.南京农业大学 2007
本文编号：3342815
【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．?（Ａ／Ｂ）斜带石斑鱼克隆得到的目的片段点泳检测??
可编码一个包含５１８个氨基酸的蛋白（图２．?Ａ）。而斜带石斑鱼中ＡＭＨＲＩＩ受体基??因序列长为１８２２ｂｐ，含有１４９７?ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），可编码一个包含４９８??个氨基酸的蛋白（图２．?Ｂ）。我们对ＡＭＨ和ＡＭＨＲＩＩ进行了基因序列Ｎ端信号肽??预测，信号肽长度分别为２２个和２１个氨基酸，如（图２．?Ａ）和（图２．?Ｂ）中红色阴影??表示。??ａｔｇｃｔｇｔｔｔｇｔｇｇａｃａｔｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｇｇａｇｃｇｔｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｇｃｃｃｇｇｃｔｃｔｇｔｇｃａｇｃｃｃｔｇｃａｇｇｔｃｔｃａｃａｔｇｇａｃａｇｃａｇ??ｌｑｖｓｈｇｑｑ??ｃｔｇａｔｔｇａｃｇａｃｃｃｃｇｃａｇｔｇａｃａｇａｇｃａｃａｃｃｃａｔｃｃａｔｃａｇｃｃｔｃｃａｃａｇｔｃｔｃｃｃａｔｃａｃｇｃｃｃｃｔｃａｃａｇｔｇｃａｃｃｇｔｇｃｔｔｔｇｔｇ??ＬＩＤＤＰＡＶＴＥＨＴＨＰＳＡＳＴＶＳＨＨＡＰＨＳＡＰＣＦ！??ｇａｔｇａｃａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇｃｔｇｃｇｔｇａａｇｇｔｇｔｔｇｇｇａｇｃｇａｃｇｇｔｇａａｃｔｃａｃａａａｃｃｇｃａｇｔｔｔｇｇｃｔｃａｇｔｔｔｇｇｇａｔｃｔｇｃａｃｔｇａａ??ｔｃｔｇａｃａｇｃｔｃｔｔｃａｇｔｃｔｔａｔｔａｃａｇｃｔｇｇｃｔａａｔｇａａａｃａａａｃａａａａａｃｃａｇｇｇａａａｔｇｇａｔｔｇａａｇｇｔｔｔｔｇｃａｔｃｃａｇｇｔｇｇａｇｇａ??ａｔｃａｇａｇｇｔｇｔｃａａａｇａｔｇａｇａｃｇｇｇａａｃｔｃｔｃｇｔｇｔｔｇａｃｃｔｔｔｇａｃｃｔｃｔｃａｃｔｇｔｃｃｃｃｔｔｔｇｃｔｇａａｇｇｔｇａａｃｃｃｔｇｔｇｔｔｇｃｔｇ??ｔｔｇｇｃｇｔｔｔｇａａａｇ
中最后留存的为线性化质粒，于－２０Ｔ：保存。??述过程中所用的明和其他耗材均为ＲＮａｓｅ?ｆｒｅｅ。??反转录??线性化质粒浓度后，我们对线性化质粒进行反转录，具体反应成分?体积（ｕＬ）线性化质粒（ｌｕｇ）?Ｘ??ＲＮａｓｅ?ｆｒｅｅ?Ｈ２Ｏ?１３－Ｘ??ｌ〇ｘＮＴＰ?ｌａｂｅｌｉｎｇ?ｍｉｘｔｕｒｅ?２．?０??ｌ〇ｘＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｂｕｆｆｅｒ?２．?０??ＰｒｏｔｅｃｔｏｒＲＮａｓｅ?ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒ?１．０??Ｐ６?ＲＮＡ?ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ?（Ｔ７为正?２．?０??向，ＳＰ６为反向）?２０．０??Ｔｏｔａｌ??件为：冰上混匀后３７°Ｃ，?２ｈ；加入２ｕＬ?ＤＮａｓｅｌ后，３７°Ｃ，１ＥＤＴＡ终止反应。分装后产物于－８０°Ｃ保存。浓度一般为２０－ｌ
【参考文献】：
期刊论文
[1]半滑舌鳎抗缪勒氏管激素（AMH）基因的克隆及组织表达分析[J]. 刘姗姗,孙冰,梁卓,张静,陈松林. 中国水产科学. 2013(01)
[2]细胞受体的种类与功能[J]. 汪静儿,钟万锷. 生物学教学. 2012(08)
[3]罗非鱼AMH基因的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 丁炜东,曹哲明,曹丽萍. 水产学报. 2010(05)
[4]凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析[J]. 姚翠鸾,冀培丰,孔鹏,王志勇. 水产学报. 2009(06)
[5]奥利亚罗非鱼AMH基因结构及其表达[J]. 唐永凯,李建林,俞菊华. 水产学报. 2009(03)
[6]抑制素、活化素和卵泡抑素研究进展[J]. 田锦,李志敏,傅衍,王振玲,周珍辉,齐军喆,孙建. 动物医学进展. 2008(12)
[7]石斑鱼性逆转研究现状[J]. 邢晨光,金珊,袁思平. 水产科学. 2006(04)
[8]斜带石斑鱼人工育苗技术的初步研究[J]. 史海东,辛俭,毛国民,於海滨. 浙江海洋学院学报(自然科学版). 2004(01)
[9]脊椎动物性别决定和分化的分子机制研究进展[J]. 周林燕,张修月,王德寿. 动物学研究. 2004(01)
[10]抗苗勒氏管激素（AMH）对卵巢功能的调节[J]. 陈秀萍,丁利军,丁家桐. 上海畜牧兽医通讯. 2004(01)
硕士论文
[1]尼罗罗非鱼Dmrt1、Amh和Cyp11b2抗体制备及其在正常发育和性逆转性腺中的表达研究[D]. 王婷茹.西南大学 2013
[2]黄河鲤和两种泥鳅中AMH基因的克隆及其表达分析[D]. 豆晓飞.河南师范大学 2013
[3]半滑舌鳎AMH基因的克隆及表达分析[D]. 刘姗姗.上海海洋大学 2012
[4]Vasa、卵泡抑素（FST）和抗缪勒氏管激素（AMH）在半滑舌鳎繁殖周期中的作用研究[D]. 张远青.中国海洋大学 2012
[5]两种生防活性蛋白HarpinXooc和AiiA的表达及生物活性检测[D]. 何丹.南京农业大学 2007
本文编号：3342815
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