Notch分子参与嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌的动态变化研究
发布时间：2021-09-03 14:34
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是一种人兽共患的致病菌,不仅会导致海洋动物的弧菌病,还能引起人类患败血症、肠胃炎和伤口感染。嗜中性粒细胞的吞噬作用是机体天然免疫中对抗感染和损伤的一个重要防御机制。由于斑马鱼在受精后的前三周只存在先天免疫,使它具有哺乳动物等其他实验模型不具备的优势,目前斑马鱼已广泛的应用于宿主和病原体相互作用的研究中,尤其在天然免疫应答研究中具有突出优势。为了探究副溶血弧菌和斑马鱼嗜中性粒细胞之间的动态变化,以及Notch分子参与天然免疫应答的作用,本实验首先通过三亲本杂交的方法将带有红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的质粒转化至Vp57中,获得了荧光标记的细菌,命名为Vp57RFP。检测了RFP标记的质粒在Vp57中的稳定性和Vp57在标记前后生长曲线及毒力的差异,为后续示踪Vp57RFP感染嗜中性粒细胞实验提供了宝贵的材料。之后,观察了Vp57RFP在斑马鱼体内与嗜中性粒细胞之间的动态变化,建立了人工感染3dpf（days post...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1. 副溶血弧菌
1.1 副溶血弧菌的毒力
1.2 副溶血弧菌的危害
2. 常见的原核生物基因重组方法
2.1 化学法
2.2 电击转化法
2.3 三亲本杂交
3. 先天免疫
3.1 斑马鱼嗜中性粒细胞在先天免疫中的作用
3.2 先天免疫分子
4. Notch分子在免疫中的作用
4.1 Notch信号通路的概述
4.2 Notch信号对嗜中性粒细胞的负向调控作用
5. 报告基因
6. 本研究的目的和意义
第二章 利用三亲本杂交标记副溶血弧菌Vp57
1. 实验材料
1.1 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 实验菌株
2. 实验方法
2.1 复苏Vp57及S17-1λpir
2.2 pVSV209质粒转化
2.3 三亲本杂交
2.4 荧光正置显微镜观察
2.5 PCR鉴定
2.6 16SrRNA测序
3. 实验结果
3.1 荧光显微镜观察
3.2 PCR结果
3.3 16SrRNA测序
4. 讨论
第三章 副溶血弧菌Vp57在标记前后生理特性的比较
1. 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2. 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 Vp57和Vp57~(RFP)生长曲线的绘制
2.3 质粒稳定性检测
2.4 Vp57与Vp57~(RFP)的毒力测定
2.5 斑马鱼感染后的临床症状及细菌分离
2.6 病理切片
3. 实验结果
3.1 Vp57与Vp57~(RFP)的生长曲线
3.2 质粒pVSV209的稳定性
3.3 Vp57与Vp57~(RFP)的毒力
3.4 临床症状及细菌分离
3.5 病理切片
4.讨论
第四章 Vp57~(RFP)和斑马鱼嗜中性粒细胞的动态变化研究
1. 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2. 实验方法
2.1 嗜中性粒细胞形态学观察
2.2 菌液准备
2.3 显微注射
2.4 荧光正置显微镜观察
3. 实验结果
3.1 嗜中性粒细胞形态学观察
3.2 Vp57~(RFP)的感染路径及其与嗜中性粒细胞的相互作用
3.3 细菌对斑马鱼致死现象的观察与统计
4. 讨论
第五章 Notch1a参与Vp引起的嗜中性粒细胞相关基因的应答变化
1. 实验材料
1.1 实验菌株
1.2 实验用鱼
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2. 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 显微注射
2.3 斑马鱼卵及幼鱼的浸泡感染
2.4 Trizol法提胚胎总RNA
2.5 反转录获得cDNA
2.6 荧光定量PCR（Q-PCR）检测细胞因子及补体基因的变化
3. 实验结果
4. 讨论
第六章 斑马鱼细胞因子启动子的构建和报告基因载体的活性分析
1. 材料与方法
1.1 实验用鱼
1.2 试剂
1.3 主要仪器
2. 实验方法
2.1 斑马鱼细胞因子启动子的预测及其转录因子结合位点分析
2.2 斑马鱼基因组提取及细胞因子启动子的PCR扩增
2.3 报告基因pGL3-Enhancer载体的构建
2.4 报告基因载体转染细胞后荧光素酶表达活性测定
3. 结果与分析
3.1 tnfb、il11b和il13启动子转录因子结合位点分析
3.2 tnfb、il11b和il13启动子序列的扩增
3.3 tnfb、il11b和il13报告基因载体的构建
3.4 细胞因子报告基因在Raw264.7细胞中的表达
4. 讨论
总结和展望
参考文献
附录
致谢
本文编号：3381293
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1. 副溶血弧菌
1.1 副溶血弧菌的毒力
1.2 副溶血弧菌的危害
2. 常见的原核生物基因重组方法
2.1 化学法
2.2 电击转化法
2.3 三亲本杂交
3. 先天免疫
3.1 斑马鱼嗜中性粒细胞在先天免疫中的作用
3.2 先天免疫分子
4. Notch分子在免疫中的作用
4.1 Notch信号通路的概述
4.2 Notch信号对嗜中性粒细胞的负向调控作用
5. 报告基因
6. 本研究的目的和意义
第二章 利用三亲本杂交标记副溶血弧菌Vp57
1. 实验材料
1.1 主要试剂
1.2 主要仪器
1.3 实验菌株
2. 实验方法
2.1 复苏Vp57及S17-1λpir
2.2 pVSV209质粒转化
2.3 三亲本杂交
2.4 荧光正置显微镜观察
2.5 PCR鉴定
2.6 16SrRNA测序
3. 实验结果
3.1 荧光显微镜观察
3.2 PCR结果
3.3 16SrRNA测序
4. 讨论
第三章 副溶血弧菌Vp57在标记前后生理特性的比较
1. 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2. 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 Vp57和Vp57~(RFP)生长曲线的绘制
2.3 质粒稳定性检测
2.4 Vp57与Vp57~(RFP)的毒力测定
2.5 斑马鱼感染后的临床症状及细菌分离
2.6 病理切片
3. 实验结果
3.1 Vp57与Vp57~(RFP)的生长曲线
3.2 质粒pVSV209的稳定性
3.3 Vp57与Vp57~(RFP)的毒力
3.4 临床症状及细菌分离
3.5 病理切片
4.讨论
第四章 Vp57~(RFP)和斑马鱼嗜中性粒细胞的动态变化研究
1. 实验材料
1.1 实验用鱼
1.2 主要试剂
1.3 主要仪器
2. 实验方法
2.1 嗜中性粒细胞形态学观察
2.2 菌液准备
2.3 显微注射
2.4 荧光正置显微镜观察
3. 实验结果
3.1 嗜中性粒细胞形态学观察
3.2 Vp57~(RFP)的感染路径及其与嗜中性粒细胞的相互作用
3.3 细菌对斑马鱼致死现象的观察与统计
4. 讨论
第五章 Notch1a参与Vp引起的嗜中性粒细胞相关基因的应答变化
1. 实验材料
1.1 实验菌株
1.2 实验用鱼
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
2. 实验方法
2.1 菌液准备
2.2 显微注射
2.3 斑马鱼卵及幼鱼的浸泡感染
2.4 Trizol法提胚胎总RNA
2.5 反转录获得cDNA
2.6 荧光定量PCR（Q-PCR）检测细胞因子及补体基因的变化
3. 实验结果
4. 讨论
第六章 斑马鱼细胞因子启动子的构建和报告基因载体的活性分析
1. 材料与方法
1.1 实验用鱼
1.2 试剂
1.3 主要仪器
2. 实验方法
2.1 斑马鱼细胞因子启动子的预测及其转录因子结合位点分析
2.2 斑马鱼基因组提取及细胞因子启动子的PCR扩增
2.3 报告基因pGL3-Enhancer载体的构建
2.4 报告基因载体转染细胞后荧光素酶表达活性测定
3. 结果与分析
3.1 tnfb、il11b和il13启动子转录因子结合位点分析
3.2 tnfb、il11b和il13启动子序列的扩增
3.3 tnfb、il11b和il13报告基因载体的构建
3.4 细胞因子报告基因在Raw264.7细胞中的表达
4. 讨论
总结和展望
参考文献
附录
致谢
本文编号：3381293
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